Трансгенни животни: технологията на

Видео: Bioseminars.ru: Егор Malashichev - Трансгенни животни и сравнителна ембриология

За разлика от растения, където има възможност за получаване на плодородно растение от трансформирана соматични клетки и клониране, производство на трансгенни животни - много труден и продължителен процес.

Стратегията се използва, е, както следва:
1. клонирания ген се въвежда в оплодената яйцеклетка ядро.
2. оплодената яйцеклетка с екзогенна ДНК, се имплантират в женски получател (след успешното приключване на ембриона бозайник при други обстоятелства невъзможно).
3. отвеждане потомство разработен от имплантирани яйца, които съдържат клонирания ген във всички клетки.
4. кос животни, които носят клонирания ген в клетки на зародишна линия и дават нов генетичен линия.

Опитите с генетично модифицирани многоклетъчни организми чрез въвеждане на трансгени в тях се нуждаят от много време. Въпреки това, трансгенни стане мощен инструмент за изследване на молекулните основи на генната експресия и развитие на бозайник, за създаване на моделни системи, което позволява изследването на човешки болести, както и генетичната модификация на млечните жлези на животински клетки за производство на млечни протеини важни за медицината. Имаше дори нова Терминът "фарминг» (фарминг), позовавайки се на метода за получаване на млякото на трансгенни животни автентични човешки белтъци или фармацевтични продукти.

Използването на мляко е целесъобразно, тъй като се образува в организма на животното в големи количества и да nadaivat, колкото е необходимо, без да навреди на животното. Произведени от млечната жлеза и се секретира в млякото не е нов протеин трябва по този начин проявяват нежелани ефекти върху нормалните физиологични процеси в трансгенно животно, и се подлага на пост-транслационна промяна, че най-малко близки до тези в човешките клетки. В допълнение, изолацията от мляко, което съдържа и други протеини, не трябва да бъде твърде трудно.

Въпреки факта, че първата трансгенното животно са получени през 1985 г. въвеждането на екзогенна ДНК в pronuclear зиготи все още не е разработен ефективен метод, който може да се използва за създаване на генетично модифицирани животни, независимо от вида и целта на експеримента. Развитие на нови ефективни методи на генен трансфер на ембриони и соматични клетки на животни, както и подобряването на съществуващите подходи спешна задача.

Сред голямото разнообразие от начини за въвеждане на екзогенна ДНК в генома на животните могат да бъдат разграничени, които са широко използвани в практиката на трансгенни:
- метод микроинжектиране,
- ретровирус-медиираната генен трансфер,
- modifitsirovanngh използването на ембрионални стволови клетки,
- прехвърляне на трансформирани ядра генеративни и соматични клетки
- използването на сперматозоидите и сперматогони като вектори на ДНК.

Наред с другите методи за доставяне на екзогенна ДНК в организъм на животни може да се отбележи, използването на липозоми, аденовирусни вектори, както и метод високоскоростен инжектиране. Въпреки това, тези методи не са широко използвани заради тяхната недостатъчна стабилност и липса на интеграция на трансген в генома.

Микроинжектирането на рекомбинантна ДНК в оплодени ооцити на многоклетъчни животни са все още най-популярния начин за въвеждане на чужди гени в животни. Въпреки факта, че този метод изисква високо умение и скъпо оборудване, простота и надеждност плащаме всички свои недостатъци.

Първата и най-добре установена експериментална система за производство на трансгенни животни е мишката. Донор женски мишки с експериментален суперовулация комбиниран с мъже за получаване, след 12 часа се изолира оплодени яйца и се поставят в култура. Освен това, по-голямата от двете клетъчно ядро (обикновено мъжки) се инжектират с рекомбинантна ДНК (фиг. 2.17). Оцелели инжектирани яйце се трансплантират в женски получател. Само част от трансплантираните яйцеклетките продължи да развива до отелване.

Фиг. 2.17. Микроинжектирането на екзогенна ДНК в проядрата на оплодени яйцеклетки бозайник под микроскоп (а) и експериментална настройка (В)

Честотата на интеграция на екзогенна ДНК се използва метод микроинжектиране се влияе от такива фактори, като чистотата на инжектиране на пробата, формата и концентрацията на ДНК, съставът на буферния разтвор за микроинжектиране, качеството на ембрион, и метод за трансфер на ембриони получател (нехирургичен, хирургически, лапароскопска).

Трансгенните животни се идентифицират в потомството на различни методи, повечето от PCR и комбиниран с получаване на трансгенни линии. Някои от трансгенните животни са мозайка (зародишни клетки не съдържат екзогенна ДНК) чрез кръстосване трансгенни следователно е по-малка част от първо поколение от изчислената 50%. В някои случаи, хомозиготни линии, които не могат да се получат поради трансгенни инсерции 5-15% хомозиготни летална, като вмъкването понякога нарушава жизнените части на генома.

Точният механизъм за интегриране на инжектираната ДНК в хромозомите на прицелни клетки не е известен, но анализ на вмъкнатите ДНК структури разкрива някои точки. Интеграция възниква случайно в един хромозомен локус, който може да съдържа един до няколко хиляди тандемни копия на интегрираната ДНК. Около 30% от първичните трансгенни животни, получени обикновено проявяват известна степен на мозайка, които могат да са резултат от интеграция на екзогенна ДНК репликация след първия цикъл.

Степента на интеграция на екзогенна ДНК в генома, т.е. брой трансгенни животни от общия брой родени животни по метода на микроинжектиране, в зависимост от вида варира до малък диапазон от 5-15%. Най-важните предвид разходите, необходимо за производството на един трансгенно животно е трансгенно цялостната ефективност индекс, който се изчислява като съотношение на получения трансгенното животно от общия брой на трансплантирани ембриони, изразени като процент. Стойността на този индекс за бозайници е относително постоянна при средно ~ 0.5% за прасета и крави до около 2% в мишки.

Ретровирусните вектори, също се използват за генериране на трансгенни животни. Инфекция на предимплантационни ембриони с рекомбинантни ретровируси - относително прост ефективна процедура.

Vosmikletochnuyu морула (фиг. 2.18) освободен от черупката и се поставя в блюдо с култура фибробласти произвеждат рекомбинантен ретровирус. Заразени ембриони достигнали етап бластула се имплантира в псевдобременните жени. В резултат на трансгенни организми са генерирани, мозайки в зависимост от броя и местоположението на вградени модули рекомбинантна ДНК в генома. Ето защо, за да се получи изчистени линии допълнително изисква мащабна outbreeding.

Недостатък на метода е да се ограничи добавянето на екзогенни ДНК ~ 8 потребителски стоки, при което трансгена може да бъде лишен от съседни регулаторни последователности, необходими за неговата експресия, и в някои случаи, да се интегрират в оригиналната локус нестабилна.

Новите лентивирусни вектори (лентивируси принадлежат към семейството на ретровируси) показаха много висока тяхната ефективност при предоставянето на ДНК в ооцити и зиготи. Инжектиране на рекомбинантните лентивирусни конструкти минута на perivitelline пространство на свине зиготи и ооцити говеда доведе до появата на потомство с най-високите понастоящем издатини на трансгенни животни. В същото време, лентивирусни вектори имат всички недостатъци на ретровирусна: малък размер вкарването на екзогенна ДНК и множествена интеграция в генома на гостоприемника, което може да доведе до нежелани странични ефекти, такива като активиране на онкогени и инсерционна мутагенеза. Освен това, лентивирусни вектори за висока степен на мозайка трансгенно потомство произведени и отделните факти шумозаглушителна (инактивиране) рекомбинантните лентивирусни последователности получени трансгенни линии.

Използването на ретровирусни вектори има един голям недостатък. Въпреки, че тези вектори са създадени така, че те са с дефектна репликация ретровирус щам геном (хелперен вирус), който е необходим за получаване на големи количества ДНК вектор може да попадне в същото ядро като трансген. Независимо от всички мерки, предприети, ретровируси помощници могат да бъдат копирани в трансгенното животно, което е абсолютно неприемливо, ако тези животни да бъдат използвани като храна или като средство за получаване на търговски продукт. И тъй като има алтернативни методи за трансгенеза, ретровирусни вектори са рядко използвани за генериране на трансгенни животни, които имат търговска стойност.

Фиг. 2.18. Схемата за получаване на линии от трансгенни мишки, използвайки ретровирусни вектори

Модифицираните ембрионални стволови клетки могат да бъдат използвани за получаване на трансгенни животни. Клетките, изолирани от миши ембриони в стадий на бластоцист, могат да се размножават в култура, като същевременно се запази способността за диференциране на всички клетъчни типове, включително линейни клетки зародиш, когато се прилагат в друга ембриони към етапа на бластоцист (фиг. 2.19).

Такива клетки се наричат плурипотентни ембрионални стволови клетки (ES). В ES-клетки в културата може да въведе целевите трансген различни техники (трансфекция, електропорация, ретровирусна инфекция и т.н.), без да се нарушава тяхната плурипотентност. Практическата Предимството на тази схема е, че той дава чудесна възможност за избор на клетки с определен параметър. Това може да бъде броя на копията на трансгена, неговите локализация или експресионни модели.

Познаването на последователност околната специфично място за желаната интеграция, може да се конструира вектор за вмъкване на целевата ДНК чрез хомоложна рекомбинация. Например, на мястото на ген, кодиращ лесно разпознаваеми индикация за целите на селекция чрез отстраняване му или възстановяване на функция в резултат трансгенна клетка.

По същия начин, така наречените нокаут мишки (нокаутира) - мишки с инактивиран насочено специфичен клетъчен ген за изучаване неговата функция. За провеждане на вектор на хомологична рекомбинация е изработена от целевия ген фрагменти, които е предвидено да инактивират част на целевия ген след това се заменя със селектируем маркер за селекция на клетки с интегриран дизайн.

Фиг. 2.19. Получаване на трансгенни мишки чрез реконструкция на ембриони използване на генетично модифицирани ембрионални стволови клетки (ES-клетки). ES-клетки са получени от вътрешната клетъчна маса на бластоцист мишка на

Избрани трансгенни ES-клетки могат да бъдат култивирани и използвани за получаване на трансгенни животни. Това предотвратява случайно вмъкване на трансген, който е характерен за метода и микроинжектиране на ретровирусни векторни системи.

Всички получени при животни схема мозайки са толкова необходимо за разплод работа, за да се получи изчистени линии. Основният проблем мозайка трансгенни животни могат да бъдат преодолени чрез трансплантиране ядра трансформирани ES-клетки в енуклеирани овоцити, които след това се продължи тяхното нормално развитие. В резултат, във всяка клетка на животно получава ще съдържа трансген.

За съжаление, плурипотентни ES-клетки, подобни на мишката, докато не се намери в други бозайници и птици, но търсенето продължава.

Ядрен трансфер на трансформирани генеративни и соматични клетки в яйце, или соматични ядрен трансфер (соматична трансфер ядрена), друг метод, използван в практиката на трансгенеза. Показано е, че ядрото на ембрионални клетки от различни животни, когато са пренесени на енуклеирано яйце понякога може да се гарантира развитието на нов организъм. След кратък период на отглеждане, дори в основата на някои от най-диференцирани клетки са в състояние да осигурят развитието на жизнеспособен индивид.

Например, известният овцата Доли беше клониран през 1997 г. от сливането култивират (3-6 пасажи) гърдата епителни клетки (вимето) възрастни животни с шест години лишен яйцеклетка ядро (фиг. 2.20). Въпреки, че ние не можем да изключим възможността, че клонирането е случайно взети недиференцирани клетки в епитела на донор.

Фиг. 2.20. Клониране на овце от ядрен трансфер. Гръдните епителни клетки в културата се индуцира да влезе фаза G0 (етап на което яйцето). След това, сливането на тези клетки с енуклиирани яйцеклетката и ембрионите се отглежда в ранните етапи на ембриогенезата. След което ембрионите се имплантират в матката на сурогатна майка, когато е по-нататъшно развитие се осъществява. В експеримента, J. Wilmut (I. Wilmut) клониране се извършва Доли 277 М енуклиран яйцеклетки с гърдата клетки във фазата на G0 от 29 оцелели ембрионите разработен само един жизнеспособен организъм

Доли Клониране на диференцирана клетка ядро и другите три овцете от ембрионални клетъчни ядра може да изпълнява чрез прехвърляне на ядра от клетки, които са в етап на покой (G0), и евентуално характеристиките на ембриогенезата на животните. В овце зиготи в рамките на първите три участъка, заемащи няколко дни, само за да се появява ДНК репликация, нито на гена не е експресиран. Предполага се, че през това време въведената ДНК се освобождава от клетки, специфични регулаторни протеини и съответните гени са свързани с ембрионално развитие ембрионални инициатор протеинови фактори от цитоплазмата на яйцето.

Докато клониране технологии са все още много далеч от съвършенството - клонирана Доли, разкриват множество признаци на преждевременно стареене, това е много обещаваща технология за производство на трансгенни животни. Дори и да има различни проблеми с първото поколение, най-вероятно, от второ поколение няма да има недостатъците, придобити чрез използването на "старите" за ядрото на яйце.

Основният проблем да бъде решен, за да създава трансгенни животни, използвайки метод ядрен трансфер е реална, - е запазването на плурипотентни клетки в непрекъсната култура. В момента се търси активно фактори препрограмиране диференцирани клетки, за да се предизвика плурипотент. Ако успее, генетичната модификация на тези клетки и създаване на трансгенни организми чрез соматична ядрен трансфер ще стане почти рутинна процедура, и докато те са изолирани успешни опити.

Изкуствени хромозоми като вектор трансген. Повечето трансгени са сДНК малки гени (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Като се има предвид всичко това, използването на стомана за трансгенни мая изкуствени хромозоми (YAC), обхващащ фрагменти от геномна ДНК дължина от 100 до > 1000 потребителски стоки и изкуствени хромозоми още по-голям капацитет (около изкуствени хромозоми). Тези епизомални вектори имат и друго предимство - избегне позиция ефект генна експресия, когато екзогенната ДНК. Нивото на експресия на въведения ген е силно зависима от своя хромозомна позиция, например, вграждането на неактивен хроматин (хетерохроматин) непокътнати хромозома води до генно инактивиране.

Използване мая изкуствени хромозоми (YAC), носещ няколко свързани гени или голям ген, трансгенни мишки са получени от микроинжектиране в проядрата на оплодената яйцеклетка, или чрез трансфекция на ES клетки. Трансгенни мишки, носещи група от пет функционален човешки глобин genovv обща дължина от около 250 потребителски стоки, като всички тези гени са изразени тъкан специфично и в точното време точно по същия начин, както в хората. Такова спазване се гарантира техните гранични последователности, които съдържат промотор и други регулаторни елементи важно. Използване на YAC-трансгенни мишки са получени, които синтезират само човешки антитела са тетрамерен сложна структура на две двойки различни полипептидни вериги.

Човешки изкуствени хромозоми (човешки изкуствен хромозом -HAC), съдържащи целия човешки имуноглобулин локус с тежки и леки вериги са въведени в рогат добитък фибробласти, които след това се използват за соматична ядрен трансфер. Получени transkhromosomalnye телета изразяват човешки имуноглобулин в кръвта си. Тази система е важна стъпка в посока на производството на животно от терапевтични човешки поликлонални антитела.

Освен това наблюдение на трансгенни животни са показали, че рекомбинантни HACs се поддържат в по-голямата част от първото поколение на индивиди в продължение на няколко години. Дали не получи изкуствени хромозоми, за да отделяте правилно по време на мейозата и наследява, то остава да се види.

Съвсем наскоро, нова обещаваща технология за животни с гени с увреждания - малки интерфериращи РНК (сирна, сирна), които се използват за изключване на гени, целящи (заглушаване). РНК интерференция - консервативен пост-транскрипционен регулаторен процес. Двуверижна малка интерферираща миРНК в 19-23 нуклеотиди се свързват специфично с нейната комплементарна последователност на шаблона целевата тРНК, насочването по деградацията на път.

РНК интерференция е част от ген регулиране система, а именно контрол / потиска транслация на иРНК на ендогенни и екзогенни вирусни елементи и може да се използва за терапевтични цели. За преходна ген изключване синтетичен миРНК бяха трансфектирани в клетки или в началото на ембриони. За стабилна ген репресия миРНК последователност следва да бъдат включени в генома като част от експресионен ген конструкт на.

Много ефективна комбинация от лентивирусни вектори с миРНК за интеграция в генома. За разлика от класическата нокаут стратегия, която изисква по-дълги линии на отглеждане, за да се получи чист инактивиран ген и в двете локуси диплоиден геном миРНК интеграция може лесно да изключите ген мишена всяко животно, на разположение на линия.

Въпреки голямото разнообразие от техники, разработени за производството на трансгенни животни, до сега не надеждна и ефективна технология за трансгенни животни. Най-големите проблеми са свързани с включването на случаен екзогенна ДНК в генома с повечето съществуващи методи. Така че технологията подобрение допълнително качество необходимо да се разработят наблюдение модифициране клетъчни гени и точно поставяне на екзогенна ДНК в генома.

Колкото повече, че по-голямата част от геномите на икономически важни организми вече напълно секвениран и могат да планират бъдещата структура на трансгенни организма. Комбинацията от напълно декодираните геномни последователности с методите за целево доставяне на екзогенна ДНК ще позволи изграждането на трансгенни насочени геноми с предварително определени свойства.

NA Warriors, TG Volova

Споделяне в социалните мрежи:

сроден