GuruHealthInfo.com

Медицинско право: право, документи, отговорности, правила, актове.



здравно законодателство


Москва, Федерален център на Държавния санитарен и епидемиологичен здравното министерство 2000UtverzhdayuGlavny gosudarstvennyysanitarny vrachRossiyskoy FederatsiiG.G.ONISchENKO24 април 2000 godaData юли 2000 vvedeniya1 goda2.3.2. Храни и хранителни DOBAVKIMEDIKO - Биологично оценяване на хранителните продукти, получени от генетично MODIFITSIROVANNYHISTOCHNIKOVMETODICHESKIE UKAZANIYAMUK 2.3.2.970-001. Разработено от Института по хранене (Tutelian VA -Head, Aksyuk в, Василиев AV, Vorobyev LS, VysotskiyV.G., Volgarev Mn, Korolev AA, Кравченко L . .В, Maganova NB, Mazo VK, Pokrovskaya GR, Sokol'nikov AA, Сорокин EY, TyshkoN.V) -. ваксини и серуми институт. II Мечников Медицински науки (Семьонов BF, Britsina MV, Захарова NS.) - (. GG Онишченко, Петухов AI) Ministerstvomzdravoohraneniya RF (Департамент за санитарна инспекция) - Московската медицинска академия. IM SechenovaMinzdrava Русия (барела NP, Sukhanov вр.) - Център"биоинженерство" RAS (Скрябин KG, Кузнецов BB, Dorokhov DB, Asadov UE.) - Медицински - Генетични център на RAM памети (Шишкин SS.) - Московския държавен университет по приложна biotehnologiiMinisterstva общото и професионалното образование RossiyskoyFederatsii (Rogov IA, ограничените NG Гюрова Н., Възли VV.). 2. Одобрен 20 Април 2000, влязъл в сила Glavnymgosudarstvennym санитарен лекар на Руската федерация от 1 юли 2000g.3. Vpervye.1 въведена. Общи разпоредби и обхват primeneniya1.1. Методически указания, определени trebovaniyakprovedeniyu медицински - биологични изследвания на хранителните продукти, получени от генетично модифицирани istochnikov.1.2. Насоки са предназначени да uchrezhdeniysanitarno - епидемиологичната служба на Руската федерация, извършване на държавния санитарен - epidemiologicheskiynadzor, както и други институции, акредитирани naprovedenie работа в тази oblasti.1.3. Изискванията на тази методическа ukazaniyahv за продукти, получени от генетично modifitsirovannyhistochnikov прилагат на етапа на производството, хигиенни изпит, държавна регистрация, осигуряването, вноса в страната и realizatsii.1.4. Методически насоки са предназначени да obespecheniyaedinogo, науката - базиран подход за оценяване на качеството на ibezopasnosti хранителни продукти, добити от geneticheskimodifitsirovannyh източници, етапи на развитие, изследване на регистрация igosudarstvennoy produktsii.1.5. Производителят на новите хранителни продукти, получени izgeneticheski модифицирани източници предназначен dlyarealizatsii на територията на Руската федерация следва да издаде eemarkirovannoy в съответствие с установената poryadkom.2. Нормативен ssylki2.1. федерален закон "На санитарно - epidemiologicheskomblagopoluchii население" от 30 март 1999 D.2.2. "Основи на законодателството на Руската федерация за граждани ohranezdorovya" от 22 юли 1993 g.2.3. федерален закон "На изменения и допълнения в Русия vZakon "защита на потребителите" и KodeksRSFSR за административните нарушения" на 9 януари 1996 г. D.2.4. Наредба за държавен санитарен и епидемиологичен правилник, приет от Руската федерация PostanovleniemPravitelstva на 5 юни 1994 г. N 625.2.5. Наредба за Държавния санитарен и епидемиологичен служба на Руската федерация, utverzhdennoePostanovleniem руското правителство дата 30 юли 1998 година. N 680.2.6. Резолюция на главния държавен санитарен федерация vrachaRossiyskoy N 7 от 6ти април 1999 "За оценка poryadkegigienicheskoy и регистрация на производството на храни, poluchennoyiz генетично модифицирани източници"0.3. Общи opredeleniyaPischevaya продукти - хранителни суровини, храни produktyi komponenty.Prodovolstvennoe техните суровини - обекти на биологични, органичен и неорганичен произход, използвани dlyaproizvodstva produktov.Pischevoy хранителен продукт -produktzhivotnogo, растителни, минерални или биосинтетичен произход, prednaznachennyydlya консумация от човека, както в обем и vpererabotannom vide.Komponent - животински вещество, растително, микробно ilimineralnogo произход и р rirodnye sintezirovannyepischevye или добавки, използвани при подготовката или proizvodstvepischevogo продукт или присъстват в крайния продукт в iskhodnomili vide.Kachestvo модифицирани храни - набор от характеристики, които определят потребителски свойства, качество на храните ibezopasnost produktsii.Bezopasnost хранителни продукти - няма опасност dlyazhizni и здравето на присъстващите и бъдещата pokoleniy.Gennaya Инженеринг - раздел на молекулярната генетика, свързани създаване stselenapravlennym в vit0ro нов ком Inácio geneticheskogomateriala (рекомбинантна ДНК) може да възпроизвежда клетъчната ifunktsionirovaniyu - hozyaine.Geneticheski модифициран организъм - neskolkoorganizmov или организъм, всеки noncellular, едноклетъчни или mnogokletochnyeobrazovaniya способен kvosproizvodstvuiliperedachenasledstvennogo генетичен материал, различен от prirodnyhorganizmov получени, използвайки методи на генното инженерство isoderzhaschie генетичен - инженерство материал, включително гени, техни фрагменти или комбинация genov.4. Процедурата за хигиеничен ekspertizyi държавна регистрация на хранителни продукти, получени от генетично modifitsirovannyhistochnikov4.1. Всички хранителни продукти, получени от източници geneticheskimodifitsirovannyh минава хигиеничен изпит poryadke.4.2 момента инсталирани. Провеждане на изследване хигиенни gosudarstvennoyregistratsii и хранителни продукти, приготвени от geneticheskimodifitsirovannyh източници се извършва в съответствие sporyadkom, Руска федерация зададете Резолюция Главна gosudarstvennogosanitarnogo лекар от 7 04.06.99 N "За оценка poryadkegigienicheskoy и регистрация на производството на храни, poluchennoyiz генетично модифицирани източници".4.3. Организации, компаниите са в центъра на санитарно-епидемиологично нормализиране, хигиеничен сертификат iekspertizy на Министерството на здравеопазването на документите и материалите на руски Federatsiikomplekt, включително: - заявление (писмо) за провеждане на хигиенни оценка igosudarstvennoy регистрация на хранителни продукти, получени izgeneticheski модифициран istochnikov-- материали, отразяващи Медицински - генетични pischevoyproduktsii оценка, получена от генетично модифицирани istochnikov-- материали, отразяващи технологично skie pischevoyproduktsii свойства, получени от генетично модифицирани istochnikov-- материали отразяващи медицински - биологична pischevoyproduktsii оценка, получена от генетично модифицирана istochnikov.4.4. Обемът и програмата за работа по оценка на качеството ibezopasnosti хранителни продукти, получени от geneticheskimodifitsirovannyhistochnikov определя от rezultatamekspertizy представени materialov.4.5. Продължава работата по оценка на качеството и bezopasnostipischevyh продукти, получени от генетично modifitsirovannyhistochnikov, фирма - производител предоставя мостри на продукти, vkolichestve необходимо dlyaprovedeniyapolnogoobemaissledovaniy.4.6. Въз основа на прегледа, предвиден imaterialov документи и резултатите от медико - генетични, технологични и медицински - биологични изследвания produktsiitsentr санитарни - епидемиологични норми, gigienicheskoysertifikatsii и експертиза руското министерство на здравеопазването подготвя blankregistratsionnogo сертификат (или мотивирано становище obotkaze) и го предава на подписването на отдел gossanepidnadzoraMinzdrava Русия. Удостоверение за регистрация podpisyvaetsyaGlavnym държавен санитарен лекар на Руската федерация, липсата на AB - главен държавен санитарен и епидемиологичен отдел, заместник-началник gosudarstvennogosanitarnogovrachaRossiyskoy Federatsii.5. Медико - генетична оценка на хранителните продукти, получени от генетично modifitsirovannyhistochnikovNeobhodimost се извършва каквато и изследвания на dannomurazdelu за всеки конкретен вид храна, poluchennoyizgeneticheskimodifitsirovannyhistochnikov определя от експерт център "биоинженерство" Руската академия на науките. Техниките, описани в точки 5.1 - 5.3 са необходими priprovedenii медицински - може да се препоръча генетична оценка на хранителни продукти, получени от генетично модифицирани istochnikov- методи, представени в точка 5.4, kakdopolnitelnye.5.1. RAPD genotipovNeobhodimoe анализ оборудване и reaktivyOborudovanie и prinadlezhnostiMikrotsentrifuzhnye тип Eppendorf епруветки и 1.5 мл 0.5 (достъпно от ДНК-аза РНК-аза фирмата Alpha) Teflon чукало и / или стъклената пръчка под razmermikrotsentrifuzhnoy тръби 1.5 мл *>тип Таблица микроцентрофуга Eppendorf (ТИТА 20 200000ob. / мин.) *>Автоматично променлива микропипета обем (Classic / студент 0.5 - 10 mkl- 5-40 mkl- 200-10000 L) за типове микропипети (връх "микро" и конвенционален) Хладилник (проба охладител) *>Плаващ за статив - "сал" probirokVesy микроцентрофуга в продължение на 0.5 kgMikroanklav - "тенджера под налягане"BidistillyatorDNK-циклер ("В амплитуда-4") Съоръжението за електрофореза разделяне DNKv фрагменти чрез агарозна гел електрофореза: източник на напрежение за електрофореза (NPC) 300 *> и устройство за хоризонтална мини - електрофореза (мини-камера) *>UV осветител за визуализиране ДНК електрофореза резултати (трансилюминатор - UVT) *>SLR тип "зенит" тип портокал svetofiltromFotoplenka "Mikrat-200"(термостат"Тето 24-15") Shaker (3D) тип Mikrovstryahivatel тръби Vortex (ТИТА 2 или 4) *>RN-metrFitotron култивиране (фитотрон-99) Таблица ламинарен бокс (BL-1) ------------------------------- - *> Определяне на продукти, които са произведени от компанията"Biokom", Москва, Rossiya.Neobhodimye реагенти и rastvoryReaktivyTris (хидроксиметил) aminometaneHCl konts.EDTANaClSDSAtsetat kaliyaEtilovy алкохол 96% агарозен за elektroforezaBromisty etidiyBornaya kislotaBromfenolovy siniyGlitserinNabor за ДНК амплифициране (Biomaster - SRL - Италия - Русия, Москва) Получаване основната rastvorov1 М Tris рН 7,5 , Разтваря се 121,1 грама TRIS в 800 мл vody.Dovesti рН до желаната стойност чрез прибавяне на kontsentrirovannoyHCl и обемът се довежда до 1 литър. Разтвор prosterilizovat.0,5 М EDTA рН 8,0. Към 186,1 грама на EDTA добавят 800 мл vody.Dovesti рН до 8,0 NaOH.5 М NaCl (реагент клас или аналитично качество). 29,22 грама на натриев хлорид, разтворен в 80 мл вода и обемът се довежда до 100 мл, prosterilizovat.10 процента SDS. Разтваря се 10 г SDS в 90 мл вода, chtobyuskorit разтваряне, разтворът се загрява до 60 ° С. С DovestipH до 7.2 чрез добавяне на няколко капки концентрирана солна киселина idovesti до 100 мл. Внимание! При теглене на SDS litsomasku облече, тъй като в контакт с лигавицата на назофаринкса etotletuchy прах е много razdrazhenie.Ekstraktsionny буфер (200 тМ Tris-HCl рН 7,5, 250 тМ NaCl, 25 тМ EDTA, 0.5% SDS). За да се приготвят 100 mlekstraktsionnogo буфер изисква 20 мл 1 М Tris-HCl (рН 7,5), 5 ml М NaCl, 5 мл 0.5 М EDTA и 5 мл 10% SDS. Довежда се разтвора до 100 vodoyobem ml.5 М калиев ацетат. 49,1 грама калиев ацетат, разтворен в 80 мл вода за довеждане на обема до 100 ml.70 процента етанол. За да се приготвят 100 мл rastvoratrebuetsya 73 мл 96% етанол и 27 мл vody.TVE 5Х буфер (0.089 М Tris база - bornayakislota 0.089 М, 0.002 М EDTA рН 8,0). За 1 литър разтвор изисква 54 gTris, 27,5 грама борна киселина (аналитично чист), 4,6 грама Na2EDTAx2H20. Dlyaprigotovleniya електрод-0,5X ТВЕ буфер трябва stokovyybufer разрежда 10 пъти с дестилирана vodoy.Bufer за прилагане на пробата 6Х (0,25-bromfenolovyysiny процента, 30% глицерол, 10 тМ Tris-HCI, 1 тМ EDTA). Dlyaprigotovleniya 10 грама зареждащ буфер изисква 2.5 mgbromfenolovogo синьо, 3 г глицерол, 0.1 мл Tris, 0.02 мл 0.5 MEDTA рН 8,0.Rastvor етидиев бромид (10 мг / мл). Разтваря се 1 gbromistogo етидиев 100 мл вода. За визуализация на ДНК в разтвор agaroznomgele използва в концентрация от 5 мкг / мл. Внимание! Vsemanipulyatsii с етидиев бромид и разтворът ДНК за провеждане vperchatkah.Vydelenie tkaniDlya от растителна тъкан производство на растителни семена, грудки или drugoyrastitelny материал покълнали при контролирани условия dopolucheniya пресни листа или растителна tkani.Vysechku лист, получени чрез затваряне на капака tipaEppendorf тръби 1,5 мл или 10-14 мг тъкан (когато vysechkupoluchit трудно) v400mlekstraktsionnogo интензивно хомогенизира буфер (необходими разтвори и реагенти) с pomoschyuteflonovogo pestika.Primechanie. За да се изолира ДНК е по-добре да се вземат младите листа smyagkimi тъкани, без никакви видими следи от унищожение. Тефлон pestikdolzhen придържа към стените на тръбите. Опитайте maksimalnominimizirovat време хомогенизиране. Хомогенизация олово dointensivnogo оцветяване зелен екстракция bufera.Probirki с хомогенат се разклаща в продължение на 5 секунди. на Vortex.Pomestit ultrathermostat епруветки и се инкубира при 65grad. С 15 мин., Съдържанието периодично разбъркване probirkimyagkim pokachivaniem.Dobavit в епруветки в 200 мкл 5 М калиев ацетат (предварително охладен в хладилник) съдържанието на епруветките и tschatelnoperemeshat светлина vstryahivaniem.Inkubirovat проба в ледена баня в продължение на 15 min.Tsentrifugirovat проба в настолна центрофуга при 16 000 грама 20min. при стайна temperature.Ostorozhno изберете 400 мкл от супернатантата в нови епруветки iosadit два обема от 96 процент етанол (охлаждане) при разбъркване внимателно. В този момент, можете да наблюдавате obrazovaniemalenkoy "медуза" или фино диспергирана суспензия. Оставете probirkina таблица 5 min.Tsentrifugirovat проби в настолен центрофуга при 16,000 д, 10 min. при стайна temperature.Osadok ДНК промивните охлажда при -20 ° С. C-70 protsentnymetanolom и се центрофугира, както е описано в предходния punkte.Rekomenduem Тази процедура се повтаря веднъж raz.Slit супернатант и се използва mikropipetkimaksimalno отстраняване на течни остатъци от ДНК probirki.Osadki сухи чрез отваряне на капака probirok.Primechanie. Обърнете внимание не пресушавайте ДНК утаяване, ДНК t.k.peresyhanie води до слаба разтворимост във vode.Rastvorit ДНК в 100 л стерилна редестилирана концентрация ideionizirovannoy vody.Izmerit DNK.Amplifikatsiya геномна DNKAmplifikatsiyu геномна ДНК се провежда в 25 ул реакционната смес (67 мМ Tris-HCl рН-8,8- 16 тМ (NH4) 2SO4- 2 тМ MgCl2- 0,01% Tween-20- 200 тМ всеки dNTP- 22:00 / мл 25 praymera- mkggenomnoy ДНК и 0.5 единици. Taq-полимераза) , Всички компоненти, с изключение на ДНК, включени в комплекта за усилване Biomaster.Sterilnye фирмата Eppendorf тип тръба 0,5 мл и се поставят vshtativ podpisat.V една от тръбите да образуват reaktsionnuyusmes последователно добавяне на компонентите, както е посочено в изготвянето реакционната смес primere.Primer + ------------------------------ + ------------------ + -------------- + | Състав | В една проба, л | На 7 проби л | + ------------------------------ + ---- -------------- + -------------- + | H2O | 16,8 | 117,6 | + ------------------------------ + ---------- -------- + -------------- + | реакционен буфер без | | || MgCl2 (10X) | 2.5 | 17,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | MgCl2 | 1 | 7 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | смес dNTP`s | 2 | 14 | + ------------------------------ + ---------------- - + -------------- + | грунд (4 AU / мл) | 0.5 | 3,5 | + ------------------------------ + -------------- ---- + -------------- + | термостабилна ДНК полимераза | 0.2 | 1,4 || (4 U / мл) | | | + ------------------------------ + ----------------- - + -------------- + | ДНК | 2 | - | + ------------------------------ + ---------------- - + + -------------- Разрежда се реакционната смес в съответните тръби probirkam.Vnesti геномна ДНК и внимателно пипетира dlyaperemeshivaniya proby.Poverh reaktsionnoysmesinasloitneskolkokapelmineralnogo масло (около 17 мкл) вземане на отстраняване на въздушните мехурчета тръби vtechenie секунди центрофугирани в настолна центрофуга и стойка perenestiproby DNK.Ustanovit термоциклер и изпълнете следната програма ДНК амплификацията: 1 цикъл: 94 ° с. С - 3 min.- 36 ° С. С - 1,5 min.- 72 ° С. С- 1,5 min.- II.33 цикъла: 94 ° С. С - 0,3 min.- 36 ° С. С - 72 ° С 1,5min.-. С - 1,5 min.- III - 1 цикъл: 94 ° С. С - 0,3 min.-36 ° С. С - 1,5 min.- 72 ° С. С - 10 min.Primechanie. Поради използването на analizarekomenduem голям chuvstvitelnostiRAPD само един термоциклер и tolkoodnim избран набор от реагенти за ДНК амплифициране. Vsereaktivy за амплификация и ДНК препарати трябва да се съхранява vmorozilnoy камера при 20 ° С. С повторното замразяване (под -20 grad.C) Получаване на термостабилна ДНК полимераза резултати в eeaktivnosti.Elektroforez агарозна гел електрофореза на загуба и визуализация produktovamplifikatsiiDlya Получаване 2 процента агарозен необходимо да се добави 1 gagarozy 0,5X ТВЕ буфер 50 мл и се смесва старателно. колбата се затваря folgoy.Kolbu агарозен постави в мини-автоклав или налягане тенджера iavtoklavirovat 15 min.Rasplavlennuyu агароза се охлажда до 50 градуса. С и се изсипва vpodgotovlennuyu гел форма, като се избягва образуването на мехурчета vgele. дебелина гел трябва да бъде 0,5 - 0,7 sm.Cherez 30 -. 40 минути, когато се образува гел, премахване grebenkui го прехвърля към камерата за електрофореза, predvaritelnozapolnennuyu ТВЕ буфер 0,5X. Гелът трябва да бъде напълно pokrytbuferom с 1 - 2 mm.K 2 ул зареждащ буфер добавят 10-13 л reaktsionnoysmesi съдържащ ДНК амплификация продукти peremeshatpipetirovaniem и внимателно се прилагат към ямките на агарозен гел. В крайна lunkunanesti молекулен маркер massy.Primechanie. Обикновено маркер massyispolzuyut ламбда фаг ДНК молекулно обработва с рестрикционен ензим Hind III на или Pst I iEcoR I.Elektroforez извършва при 50 V (5 V / cm) bromfenolovyysiny докато достигне нивото на 1 см от ръба на гела. Обикновено elektroforezdlitsya 3 - 3.5 chasa.Dlya визуализиране амплифицирани ДНК фрагменти gelpomeschayut в разтвор на етидиев бромид (5 мг / мл) и provodyatokrashivanie продължение на 20 минути. на kachalke.Primechanie. С разтвор на етидиев бромид и се движи в оцветен gelemneobhodimo perchatkah.Chtoby намали фон флуоресценция причинени bromistymetidiem, гелът се промива два пъти с дестилирана вода pripostoyannom pokachivanii.Primechanie. Продължително измиване на гела може да доведе kischeznoveniyu слабите области и ерозия спектри поради diffuzii.Gel поставят върху трансилюминатор филтър и изглед vprohodyaschem UV светлина през защитния екран и специално zaschitnyeochki. Ако е необходимо RAPD спектри oranzhevyyili снимки чрез червен филтър от типа на филм "Mikrat", Fragmentyamplifitsirovannoy ДНК след лечение с етидиев бромид под UV budutflyuorestsirovat оранжево tsvetom.Primery използвайки анализ RAPD за identifikatsiigenotipov kartofelyaV хартия 19 се използва декамерни праймери. картофено Spektryamplifitsirovannoy ДНК имаше големи kolichestvofragmentov различни дължини. RAPD спектри анализ класове kartofelyas използвайки праймер РТА-19 показа значителни видове polimorfizmmezhdu (фиг. 1) *>, Получените данни показват някои колебания osuschestvennoy сортове intravariety starinnyhotechestvennyh. Използване chislapraymerov ограничено до различни степени получени RAPD спектри spetsifichnyedlya отделен клас. Анализ на спектъра позволява ДНК vyyavitneznachitelnye разлики между тясно свързани класове дори techto са произведени като сомаклонални варианти на един и идентификация анализ случаите ВТЕХ на zheroditeley.Osnovannaya ДНК може да се използва, когато сортове, които не могат да бъдат надеждно отличава porezultatam протеин електрофореза, включително vsehstadiyah анализ по време на развитието на растението. разработила бърз метод за изолиране на ДНК от glazkovkartofelya и RAPD техника, за да помогне за намаляване на времето и stoimostanaliza. Идентификация от сортове ДНК анализи могат да бъдат sdelanamenee от 24 ch.Kontrol соматични изменения в генома и размножени invit0ro трансформирани картофи на същите праймери dokazalvysokuyu ефикасност на ДНК анализ за идентифициране genotipovrasteny (фиг. 2) *>.-------------------------------- *> Чертежите не са privodyatsya.Zaklyuchenie. Предложени изолация мик на геномна ДНК izrastitelnogo материал за RAPD-анализ е бърз, икономичен, тъй като тя не изисква скъпо оборудване ireaktivov в сравнение с другите методи на молекулярната биология otsenkirastitelnyh генотипове, а също и лесна за изпълнение. Rastitelnyymaterial може да се приема като от област оранжерията и се отглеждат vlaboratornyh условия. Това не изисква микрометод bolshihkolichestv растителна тъкан (1 - 20 мг), което е bolshimpreimuschestvom в сравнение с други методи, тъй като растението за допълнително pozvolyaetsohranit raboty.Perechislennyedostoinstva този метод дава много удобно, когато се работи с голям брой проби за анализ на масата, а също priizuchenii отделните генотипове rasteniy.5.2. Определяне дали трансгенни DNKv крайни продукти pitaniyaStandartno opredeleniyanalichiyachuzherodnogo приема методи за генетичен материал и анализ продукти yavlyayutsyaimmunologichesky и идентификация на трансгенна ДНК в pomoschipolimeraznoy верижна реакция (PCR). Това проучване pischevyhproduktov, произведен изходен selskohozyaystvennoesyre подлага на топлинна обработка, може да даде immunologicheskiyanaliz нестабилна и слабо vosproizvodimyerezultaty като денатурирани протеини често не са sposobnyvstupat специфична реакция с антитела срещу нативния belku.Polimerazno - верижна реакция в този смисъл е tempreimuschestvom че термична обработка суровини не влияе nakachestvo ДНК като шаблон и по тази причина, съдържащи се в produktahpitaniya и полуфабрикати макс остатъчна ДНК суровина priprovedenii PCR дава същите резултати като роден критерий DNK.Vtorym да изберете PCR като метод за анализ на чувствителност на yavlyaetsyavysokaya превъзхождащ поне dvaporyadka metodov.Pomimo известни имунологични чувствителност на PCR е много по-скъпо и boleestabilnym метод в сравнение с други методи за анализ. Odnimnemalovazhnym Друго предимство на PCR е, че синтетичните олигонуклеотиди използвани vreaktsii ако правилно vyboremogut се прилага за анализ на различни трансгени, че в случай на имунологични методи nevozmozhno.Metody определяне дали трансгенни DNKv завърши хранителни продукти посредством polimeraznoytsepnoy reaktsiiVydelenie produktaV ДНК от метод за изпитване е избран разпределение ДНК решаваща роля igraetsoderzhanie масло в хранителни продукти. С повишена soderzhaniimasla (шоколад, рафинирано растително масло и т.н.) Допълнителна суспензия nepolyarnyhrastvoriteley екстракция с вода. Това дава възможност за прехвърляне на ДНК, съдържаща vpischevom продукт във водната фаза, в която почистване proizvoditsyadalneyshaya. За окончателното техниката за почистване ispolzuetsyaoriginalnaya разработен в центъра "биоинженерство"Обикновено дължината на PCR фрагмент в идентифициране трансгенни ДНК neprevyshaet 1000 базови двойки, обаче nizhesleduyuschihmetodik формира основата за процедурите за изолиране и пречистване на poluchitdostatochno чисти ДНК препарати за PCR. техники за вземане на проби Vtorymkriteriem е изискването да се сведе до минимум времето, прекарано на разпределението на един DNK.Metodika1 наркотици. 0,5 г проба храна се хомогенизира с тефлонов пестик или pomoschisteklyannogo в 0.5 мл буфер А (100 mMt0ris-HCl, рН 8,0, 50 тМ EDTA, 500 тМ NaCl, 10 тМ бета-меркаптоетанол) 0.2. След хомогенизиране, 100 мкл от 20% SDS. Smestschatelno смесват и се инкубират в продължение на 20 - 30 мин. на 65 градуса. В.3. Охлажда се до 4 ° С. С, се прибавя 0,3 мл 5М калиев ацетат, разбърква се чрез завихряне и се центрофугират в продължение на 10 минути. в 15000ob. / мин. в микрофужна при стайна temperature.4. Към супернатантата се прибавя 1 мл от Wizard смола максипрепарати (Promega, САЩ) и сместа се инкубира в продължение на 10 минути. при 25 градуса. В.5. След това, получената смес се изпомпва чрез мини kolonkuWizard (Promega, USA), промива се с 2 мл 80% изопропанол, otzhimayutostavshiysyavmini-kolonkeizopropanoltsentrifugirovaniem в микроцентрофуга (15,000 об. / Мин., 2 мин.). 6. Микроколона прибавя 50 мкл дестилирана вода, загрята до 65 ° С. Х.7. Инкубирайте мини - колона от вода за 10 минути. на 65 градуса. С, iotzhimayut ДНК разтвор в чиста стерилна mikrotsentrifuzhnuyuprobirku центрофугиране в микроцентрофуга (15,000 об / мин в продължение на 2 мин ...) В зависимост от съдържанието на ДНК на определена храна стопанство единица полимераза -. Обем верижна реакция 50mkl изисква от 2 до 20 мкл от получения DNK.Obraztsy приготвяне на храна с повишено съдържание на масло peredvydeleniem ДНК се подлага на допълнителна ekstraktsiiemulsiey хлороформ vode.Dlya на 0.5 г от продукта се хомогенизира smesi0,5 мл буфер и 0.5 мл хлорофил скобата 20 и хомогенатът се инкубира min.pri 56 ° С. С. След това се охлажда до 4 ° С. С и tsentrifugiruyut10 минути. при 15,000 об. / мин. в микроцентрофуга при стайна temperature.Vodnuyu фаза се събира и се прехвърля в чиста епруветка. Daleeprodolzhayut от етап 2 metodiki.Vybor гореизложеното праймери за PTsRDlya точно определяне на наличието на трансгенна ДНК да бъдат осигуряване компанията предоставя информация molekulyarnoystrukture вложка трансген, а именно нейното nukleotidnayaposledovatelnost. Това изискване се въвежда, за да canwas идентифицираме точно наличието на специфични geneticheskoykonstruktsii. В този случай, синтетични олигонуклеотиди се синтезират чрез PCR dlyaprovedeniya така че vyyavitfakt присъствие на трансген кодиращ регион. Дължина prianalize специфични праймери, използвани трябва да бъде най-малко 25 parnukleotidov за да се избегне появата в резултат на продуктите на реакцията PTsRnespetsificheskih случай, в който да бъдат представени nemozhet такава информация за някои от причините (например, фирмата - процесор мощност proizvoditelproduktov е само proizvodimogodrugoy организация трансгенни суровина ) provoditproverku необходимо за присъствието на секретираните продукти тествани DNKnabora стандарт експресионни касети, използвани в т rovoypraktike за производство на трансгенни растения. За тези otnosyatsyapraymery за идентифициране на гени селективно резистентен маркер (резистентност към неомицин ген NPT II и хигромицин HPH), atakzhe стандартно използвани области на промотор (E35S промотор virusatsvetnoy зеле и т.н.) .Vybor условия на PTsRDlya анализ се използват стандартни праймери в света ispolzuyutobscheprinyatye условия PTsR.Dlya случаи на специфични праймери условия подбор provedeniyaPTsR се извършва за всеки случай otdelno.Apparatura приложимо в PCR анализ eerezultatovAnaliz присъствието на трансгена вмъкване на ДНК, съдържаща vproduktah мощност се извършва ДНК амплификатор "VP-4"произведен "Biocom"Москва. Закаляване obraztsovosuschestvlyaetsya на сухи термостати "Термо 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Москва. За PCR Taq произведени ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Москва. Analizproduktov PCR се провежда при използване рестрикционен анализ etihproduktov чрез агарозна гел електрофореза и получената модел на posleduyuschegofotografirovaniya трансилюминатор твърдо UVTIproizvodstva "Biocom"Москва, на филм "Mikrat -Izopan" използвате фотоапарата "зенит" или в дигитална форма pripomoschi цифров фотоапарат "Kodak DC 120".Fotootpechatki или отпечатъци направени на лазерен принтер с разделителна способност от поне 600 точки на инч, трябва да бъдат приложени kprotokolu на ispytaniy.5.3. PCR идентификационен blizkorodstvennyhshtammov bakteriyV настоящите техники на молекулярната биология са базирани naprimenenii полимеразна верижна реакция (PCR) са всички boleeshirokoe използване за диагностични цели и изрази - analizaraznoobraznogo биологичен материал. Интензивни методи razvitiepodobnyh поради много високата чувствителност на PCR, възможността за бързи резултати (в odnogorabochego на ден), ниската цена на получените резултати (в сравнение с други методи) и преработка (vozmozhnostyuorganizatsii текущата работна група почти lyubyhusloviyah до мобилен изрично - лаборатория) .Other молекулна - биологични методи или изискват dlyasvoey realizatsiiorganizatsiispetsialnooborudovannyhdorogostoyaschih лаборатории или осигури разрез ultaty с nizkoydostovernostyu.Tipichny пример за невъзможността на dostovernoyidentifikatsii - филогенетичен анализ на тясно свързани видове ponukleotidnoy 16SpPHK последователност на гена. Такова analizyavlyaetsya обичаен за пълно описание на новооткритите vidovbaktery но дава ниска надеждност на popytkerazlichit тясно свързани видове, както това се случва в промишлени щамове sluchaeidentifikatsii St0reptomyces izgruppy B.anthracis.Metod бацили или бактерии идентификация използване PTsRVybor metodaSredi основава на използването на PCR молекулно - проучвания biologicheskihmetodov биоразнообразието най-подходяща за tseleyidentifikatsii бактерии е методът на т.нар DAF-PCR, разработен от Caetano - Annoles (Caetan о - Annoles G, Bassam Както J, Gresshoff PM (1991) ДНК амплифициране отпечатъци използване veryshort arbit0rary олигонуклеотидни праймери, Bio / Technology 9: 553 -556) .. Както и при други методи, те или изискват slishkomobshirnoy информация за структурата на генома на даден организъм (директно откриване на щам - специфични гени), или получаване nepolnuyudlya идентификация на тясно свързана информация видове (RAPD-PCR, DALP-PCR), или твърде сложни и скъпи, и не могат bytrekomendovany за широкото използване (AFLP-PCR) .Edinstvennym пречка в DAF-PCR е изборът на подходящ dlyatochnoy идентифициране кратко олигонуклеотид praymerov.Vybor praymerovRazrabotannoe vtsentre "биоинженерство" RAS programmnoeobespechenie за нуклеотидна последователност анализ polnyhgenomnyh бактерии позволява избор oligonukleotidnyhpraymerov за DAF-PCR, осигурява доверие identifikatsiyubaktery от нивото на напрежение, което съответства на individualnymrazlichiyam за хора и други висши еукариоти. Такова rabotaprovedena за идентификация на тясно свързани бактериална група. anthracis, за които идентификация, използвайки standartnyhmetodov (филогенетичното анализ на нуклеотидната posledovatelnostigena 16SpPHK) бе bezuspeshnoy.Vybor условия на PTsRUsloviya реакция определят степента на резултати точност ivosproizvodimosti и трябва да бъдат държани за konkretnoygruppy bakteriy.Sozdanie електронна база данни dannyhDlya пълна и надеждна идентификация на конкретната mikroorganizmaneobhodimo създаване на електронна база данни за конкретна gruppebaktery, който включва информация за максимума на СЗО mozhnomchisle различни налични като чисти култури или щамове kollektsiitipovyh bakteriy.Vydelenie DNKNaibolee надеждни резултати в PCR дава ДНК vydelennayaneposredstvenno преди насочване на реакцията на zamorozhennoybakterialnoy паста се използва метод Promega компания смола (USA) pomodifitsirovannomu контакт и Birnoboyma съотношение: - 20 - 40 ул от размразени бактериите 100mkl маси суспендират в буфер I (50 тМ t0ris HCl, рН 8,0, 5 тМ EDTA, 50 MKG / мл RNAse) .K суспензия се прибавя 120 мкл лизисен буфер (0.2 М NaOH, 1% SDS) и се очаква бактериално лизиране както се вижда възходящ виско stisuspenzii. След това, бактериални протеини и комплекс oblomkovkletochnoy стена утаяват чрез добавяне на 100 мкл от 2,55 М ацетатен kaliyapri енергично разклащане на вортекс в продължение на 5 минути. Zhestkoevstryahivanie завихря необходимо да porvatdlinnuyu бактериална ДНК, която е свързана към точките на мембрана vneskolkih, в противен случай попада osadokvmeste с SDS-протеинов комплекс. След това сместа се центрофугира namikrofuge за 5-10 минути. Супернатантата се прехвърля в микроцентрофуга за mlprobirku 1.5, съдържащ 0.75 мл смола "Wizard PCR-Prep"или "Wizard Mini Prep" компанията Promega. Сместа бе старателно peremeshivayuti се изпомпва чрез мини-колоната, смолата се промива утайка vmini колона 2 мл 80% изопропанол, центрофугира в микроцентрофуга 1 мин. при максимална скорост за да се отстрани остатъчната течност iminikolonku поставя в стерилен 1.5 мл микроцентрофужна епруветка, се прилага в малки - колона от 50 л стерилна редестилирана вода и се нагрява ilideionizovannoy тръба колона 5 минути. когато 70grad. С. След мини - колона в тръбата се поставя в микрофужна за 1 минута itsentrifugiruyut. при максимална скорост за perenosarastvora ДНК в епруветка. Описаният метод, от порядъка на 5 mkgDNK. Размерът на получената ДНК - от 3 до 15 KB, за да се отдели че vpolnedostatochno 16S РНК на бактерии (около 1500 бд priispolzovanii праймерна двойка 11F / 1492R). Предоставени ispolzovaniyasterilnyh разтвори и прибори получава ДНК могат да се съхраняват при + 4 ° С. С за шест месеца. Срок на годност на ДНК препарати при 20 ° С. С над 2 goda.Ispolzuemye реагенти и oborudovaniePTsR osuschestvlyaetsyanaDNKamplifikatorah"VP-4"произведен "Biocom"Москва. Закаляване obraztsovosuschestvlyaetsya на сухи термостати "Термо 24-15" proizvodstvafirmy "Biocom"Москва. За PCR Taq произведени ispolzuetsyatermopolimeraza "Biocom"Москва. Analizproduktov PCR се провежда при използване рестрикционен анализ etihproduktov чрез агарозна гел електрофореза и получената модел на posleduyuschegofotografirovaniya трансилюминатор твърдо UVT1proizvodstva "Biocom"Москва, на филм "Mikrat -"Izopan" използвате фотоапарата "зенит" или в дигитална форма pripomoschi цифров фотоапарат "Kodak DC 120", Iliottiski фотографски отпечатъци направени с резолюция на лазерен принтер не е menee600 DPI, трябва да се приложи към provedeniyaispytany протокол. Олигонуклеотидни праймери са синтезирани в Центъра"биоинженерство" RAN.5.4. Методи за определяне на общата svoystvgeneticheskoy vstavki5.4.1. Изолиране на геномна ДНК от полимеразна верижна реакция и поведение. За изолиране на геномна ДНК от проба на фенол продукт mozhetprimenyatsya - хлороформ или друг подходящ метод [124]. Получените ДНК препарати се съхраняват при минус 70 ° С. С iispolzuyutsya за анализ чрез полимеразна верижна реакция (NDP). Олигонуклеотидни праймери за PCR могат да бъдат predostavlenyfirmoy - производителя продукти или могат да бъдат синтезирани в съответствие с pozakazu vstavki.5.4.2 данни структура. При провеждане на PCR, използвайки Taq ДНК-polimerazaproizvodstva IBCh. В обем от 50 мкл типични експерименти polimerizatsionnuyusmes е конструиран така, че съдържа 350 nggenomnoy ДНК, 1.5 мМ всеки от chetyrehdezoksiribonukleotidtrifosfatov (фирма MBI Fermentas Lithuania), 1 единица. Taq-полимераза. След това, към сместа се прибавя полимеризация 30pkM двойка олигонуклеотидни праймери в rastvoresleduyuschego буфер състав: 67 тМ Tris-HCl буфер (рН 8,0 при 25 ° С), съдържащи 16.6 тМ амониев сулфат, 67 тМ MgCl2, 10 тМ 2-меркаптоетанол, 6 , 7 тМ EDTA, и говежди серумен албумин vkontsentratsii 170 мкг / мл. След това всяка проба се наслоява върху 50mkl минерално масло и реакцията се извършва в съответствие с програми, специално пригодени за сайт-специфичен ген ДНК амплификатор vmnogokanalnom "Termtsik" производство АД"ДНК технология" (Москва) Ако е необходимо, може да се извърши мултиплексна PCR dlyaanaliza няколко важни vstavki.Produkty амплификация фрагменти се анализират чрез електрофореза vplastine 6% полиакриламиден гел (2.5 часа при 200 V) на ДНК маркери е стандартен набор от ДНК фрагменти, получени при plazmidypBR322 действието на рестрикционен ензим Alu 1 (твърди MBIFermentas). Оцветяването на ДНК фрагменти се извършва с етидиев бромид. Анализ на резултатите и фотографиране elektroforegrammyosuschestvlyayut в usloviyahultrafioletovoypodsvetkinatransillyuminatore.5.5. Методите за оценка vstavki5.5.1 работа. Определяне на иРНК произведени чрез вмъкване, в kotorayavvedena растителния геном използване вложени PTsR.Vydelenie общо иРНК препарати от проби produktaguanidin - тиоцианат - фенол - метод хлороформ [125] iprovedenie следващите гнездене PCR праймери със декларираните [126, 125]. Откриване на синтезираната сДНК електрофорезата vpoliakrilamidnom гел с оцветяване с етидиев бромид [126] .5.5.2. Двуизмерните електрофоретични анализ belkov.V raboteispolzuyutsyasleduyuschie реагенти: акриламид, метилен бисакриламид, агароза, Tris, глицин, натриев додецил сулфат, амониев персулфат, Triton Х-100, ditiotrietol Amberlite MB-1,2-меркаптоетанол, Coomassie Brilliant Blue R-250, синьо kumassibrilliantovy G-250, Tween-20, 4-хлоро-Ь-нафтол, bychiysyvorotochny албумин - посредници "Serva" (Германия) - Tween 20 - фирми"Мерк" (Германия) амфорини рН 3-10, рН 5 - 7, рН 5-8, посредници"LKB" (Швеция) .В kachestveraskhodnyhmaterialovprimenyayutsyatakzhe: нитроцелулоза - фирми "Шлайхер и Schull"(Германия) .Belkovye vsehizuchayuschihsyabiologicheskihmaterialov екстракти получават по подобен начин като се използва obespecheniyamaksimalnoy разтваряне протеини лизисен разтвор (LR) svysokimsoderzhaniemdenaturiruyuschih агенти - урея меркаптоетанол (ditiotrietola) и Triton Х-100. LR - 9 Mmocheviny разтвор, съдържащ 5% 2-меркаптоетанол, 2% Triton Х-100, 2% амфорини 3.5 - 10.When prigotovleniiLRsnachala урея разтваря vdeionizovannoy вода и се пречиства чрез прибавяне AmberlitMV-1. След 10 мин. инкубиране Amberlite rastvorumocheviny отделя и се прибавя Triton Х-100, ditiotrietol (или 2-меркаптоетанол), амфорини рН 3-10 с добива от споменатите протеини проби kontsentratsiy.Pri тъкан бяха смлени с ножици ineskolko пъти със студен физиологичен разтвор. Zatemizmelchennuyu тъкан се хомогенизира в стъклен хомогенизатор steflonovym HR пестик в съотношение от 100 мг в 2 мл тъкан LR itsentrifugiruyut при 700 грам за 10 мин. Фракцията на супернатанта, съдържащ разтворими протеини (екстракт) се използва dlyadalneyshey raboty.Dlya анализ протеин използване двумерен електрофореза poO`Farrellu - метод, sochetayuschiyfraktsionirovaniebelkovizoelektrofokusirovaniem (pervoenapravlenie) -elektroforezom гел в присъствието на SDS [128, 129] .Izoelektrofokusirovanie провежда в стъклени тръби dlinoy150 мм и вътрешен диаметър 3.5 mm. Тръбна регулира vshtativ, нисш дупки запечатани и филм zalivayutpolimerizatsionnoy смес парафилм. За съставянето на полимеризацията smesigotovyat следните реагенти: 1,1. 30 процент акриламид, 1,6% metilenbisakrilamid.1.2. 20% Triton Х-100.1.3. 10% персулфат ammoniya.1.4. Аноден буфер за изоелектрично фокусиране: 0.01 Mfosfornaya kislota.1.5. Катод буфер за изоелектрично фокусиране: 0.02М NaOH.1.6. Защитно разтвор: 4.5 М урея разтвор, съдържащ 1% Triton Х-100-2,5% меркаптоетанол, 1% амфорини рН 3,5 - 10.1.7. За прехвърляне буфер за гел първа посока - belkovyybufer (.. виж раздел 2.2) Разтвор 1.1- 1.2- 1.6- 1.7 съхранява при 4 ° С. CON в продължение на 2 - 3 седмици. Други използват svezheprigotovlennymi.Prigotovlenie 20 мл полимеризационната смес изисква dlyazapolneniya тръби 12, извършени чрез смесване на 12 г карбамид, 6,75ml дестилирана вода, 3 мл 1,1 мл 2,25 rastvoraTritona Х-100 (20%). Тази смес се обработва с йонообменни smoloyamberlit MB-1 AN, се филтрува и към него се прибавя 225 мкл amfolinovpH 3.5 - 10 и 900 мкл амфорини рН 5 - 7. Сместа се дегазира, преди да се излее в aneposredstvenno тръба, към която се прибавя 22.5 и 32.5 mklTEMED л 10% разтвор PSA.Polimerizatsionnuyu смес се въвежда в тръбата чрез спринцовка, zapolnyayatrubki дъно до същото ниво за 2 - 3 см под verhnegokraya (височина колонна 11 см). Най vodu.Posle затваряне пластове гел полимеризация на вода си poverhnostyuudalyayut епруветка и се поставя в камера gelelektroforeticheskuyu"Bio-Rad"Модел 175 (САЩ). В долната камера nalivayutrastvor катод резервоар буфер. Пробите от тръба за анализ се прилага vobeme 50 - 150 мкл (100 цд протеин). variantefraktsionirovaniya прилага обем полу проба се повишава до 250 - 350mkl. От по-горе, краищата на тръбата са пластове защитна разтвор 1.7 iverhnyuyu анодна устройство камера е запълнена до равновесие buferom.Izoelektrofokusirovanie prinapryazhenii извършва като се излиза от 400 V до 200 V.ch, и след това при napryazhenii1000 V до 5400 V.ch сума стойност, или (нощ режим) В 210 prinapryazhenii двадесет часа и след това един час 1000 zhesummarnogoznacheniya5400V.ch.Neravnovesnyyvariantizoelektrofokusirovaniya за да се проведе при напрежение в диапазона от 400 V.ch SAR 200, и след това при 1000V V.ch за общо znacheniya1000 - 2500 V.ch .po край izoel гел колонна ktrofokusirovaniya напоена В5 прехвърля мл буфер (разтвор 1,7) на 10 минути. когато komnatnoytemperature. След това теловете не са предназначени за nemedlennogofraktsionirovaniya във втора посока ihranyat бързо замразени при -20 ° С. С за няколко секунди nedel.Dlya фракциониране napravleniiispolzuyutmodifitsirovanny метод Laemmli [130] в плаките с PAAG7,5 градиент - 25% в присъствие SDS.Dlya тази цел, се приготвят следните разтвори, от които zatemsostavlyayut полимеризация смес за образуване на плаки PAGE: 2.1. 60 процента акриламид, 0.8 protsentnyymetilenbisakrilamid.2.2. За отделяне на гел буфер: 1М Tris-HCl (рН 8,8) .2.3. Буферът за стифиране гел: 0.5 М Tris-HCl (рН 6,8) .2.4. 10% додецил natriya.2.5. 10% персулфат ammoniya.2.6. Електрод електрофореза буфер: 0.025 М Tris, глицин 0,192M, 0.1 процента SDS (рН 8,3) .2.7. Агарозен гел: 1% агарозен разтвор с dobavleniem0,125 2.6% бромофенол синьо. След готвене rastvorneobhodimo кипи в продължение на 5 мин., А преди kazhdymispolzovaniem гел трябва rastopit.Rastvor 2.5 приготвя непосредствено преди употреба, а останалата част се съхранява при 4 ° С. Втората посока C.Fraktsionirovanie извършва vplastinah размер PAGE 160 х 160 х 1 mm с линеен акриламид gradientomkontsentratsii 7,5 - 25%, в устройството за vertikalnogoelektroforeza. Гел плочки, приготвени със стандартна steklyannyhkassetah. Пример подробно използване etogooborudovaniya публикувани по-рано [131] Обикновено, за образуване на паралелни плочи 6 гел концентрация sgradientom акриламид (отделяне гел) 2 Получава се разтвор: светлина (АА концентрация 7.5%) и тежката (% концентрация АА25), 100 мл от всяка , Пълната структура на тези решения е дадено vtablitse.TablitsaSOSTAVY отделя и се концентрира ГЕЛОВЕ + ----- + ------------------------------- ----------- + --------------- + | Компоненти | разделящи гел | Концентрирането || + -------- + ------- + гел || | 25% | 6,5% | | + ------------------------------- + -------- + ------- + --------------- + | IBA-AA 60 - 0.8% мл | 41,8 | 12.5 | 3,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 1 М t0rIS рН 8,8, мл | 36 | 36 | - | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 0,5 М t0rIS рН 6,8, мл | - | - | 12,7 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | 10% SDS, мл | 1 | 1 | 0,5 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | H2O, мл | 20.4 | 49,3 | 33,3 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + | TEMED, л | 53 | 53 | 20 | + ------------------------------- + -------- + ------ - + --------------- + | 10% PSA, л | 240 | 240 | 400 | + ------------------------------- + -------- + ---- --- + --------------- + тежки и лесни решения са смесени с помощта smesitelGradient бивш Модел 395 ("Bio-Rad", САЩ) или analogichnoeotechestvennoe оборудване, така че да се получи концентрация lineynyygradient акриламид в касети, които postepennozapolnyayutsya използвайки перисталтична помпа. Обикновено едновременно попълнено плочи 6, което гарантира висока възпроизводимост identichnostihizgotovleniyai poluchennyhrezultatov. След напълване в полимеризацията smesnaslaivayut вода. Полимеризацията продължава за 30-40 минути. Zatemvodu отстранява, повърхността на гела се оцветява с филтърна хартия izalivayut разтвор образуващ стифиране gel.Dlya подготовка 50 мл разтвор се концентрира gelyaneobhodimo компоненти смесена показани в Таблица prichemkatalizatory (TEMED и PSA) се прибавя директно peredzalivkoy гел. Полимеризацията завършва в рамките на 30-40 min.Udaliv вода на повърхността на стифиране гел nakladyvayutgel първа посока и излива стопен агарозен гел (разтвор 2.7). От края на всяка плоча се образува "джоб" dlyananeseniya протеини - маркери. В рамките на 5 минути. агарозен gelzatverdevaet, гарантира пълен контакт на плочата napravleniyas гел първата гел, и се поставя в устройство за касета dlyaelektroforeza.Elektroforez се провежда при следния режим: ток 30 mA на 200 Vmaksimalnaya plastinumaksimalnoe напрежение мощност 50 Vt.Elektroforez прекратява, когато водещият ръб на багрилото dohoditdo нисш отделяне гел .След завършване на фракциониране за откриване на протеин nagelevyh плаки, използвайки оцветяване с Coomassie R-250 и азот -kislym serebrom.Okrashivanie протеини с Coomassie R-250 N oestriasis metoduFairbanks от [132] в разтвор на 10% оцетна киселина, 25-процента изопропанол, 0.05% Coomassie R-250.Okrashivanie извършват във водна баня за 15 минути. sposleduyuschey промиване несвързаният багрило 10 protsentnoyuksusnoy kislotoy.Okrasku азот - сребро се провежда в киселинна модификация Blum [133] използване на следните реагенти: Разтвор на натриев Hyposulfite (Na2S2O3 х 5H2O) - 0,2 г / л разтвор на азот - киселина сребро 200 мл - 0.4 грама от сребро -kislogo азот, 150 л на формалин разработване разтвор 200 мл: Na2CO3 - 8 д, 4 мл натриев rastvoragiposulfita, 100 мкл formalina.Vse посребряваше процеси, когато извършва в шейкър и vplastikovyh контейнери. Гелът след оцветяване с Coomassie R-250otmyvayut боя 10% оцетна киселина, за да svetlogofona. След това три пъти 20 мин. инкубират в 25-protsentnomizopropanole Отстраняването гел SDS, при което promyvayutdistillirovannoy вода (20 сек.). Освен това, в продължение на 1 мин. gelinkubiruyut в Hyposulfite разтвор и два пъти в продължение на 20 секунди. otmyvayutv дестилирана вода. В следващия етап на гела се поддържа vrastvore азот -. Кисел сребро на 15 минути, след това три пъти с по 20 секунди. промива се с дестилирана vodoy.Na крайния етап на гел се поставя в развиващия разтвор iokrashivanie спира чрез промиване с вода, гел kogdana вече се появяват нови pyatna.Fotografirovanie гелове провеждат в мокро състояние naplenku висока чувствителност (например, Mikrat 300). Гелове dlyahraneniya сушат. За тази цел, те бяха дехидратирани в разтвор, съдържащ 3% глицерол и 50% етанол в продължение на 30 мин., Zatemplotno фиксирана между два пласта от целофан и се суши при стайна vnatyanutom temperature.5.5.3. Определяне на експресионния продукт включени vstavkimetodom immunoblottinga.Dlya provedeniyaimmunoblottinganeobhodimoraspolagatsootvetstvuyuschimi миши антитела срещу протеина, кодиран от операция откриване vstavkoypolipeptida.Dlya продукт vstavkirekomenduetsya използване конюгат анти-миши имуноглобулин"Sigma" при разреждане 1: 1500 или конюгат срещу immunoglobulinovmyshi "Amersham" разредено 1: 600.Na първия анализ етап извършва електротрансфер на протеините от PAAGna нитроцелулозен филтър фирма "Шлайхер и Schull"(Германия), съгласно метода на Towbin [135] използване bufernogorastvora, съдържащ 20 тМ Tris, 0.192 М глицин, 20 protsentnyymetanol, 0,1% SDS (рН 8,3 - 8,4). Electromigration се провежда за вертикална камера B дружество със специална Електроблотингьт"BioRad" (USA) (или друго подобно оборудване) privelichine напрежение 15-16 V и ток от 120 - 160 mA techenienochi (12 - 14 часа) .След okonchaniyaelektroperenosa нитроцелулоза filtrpromyvayut в три промени на 0.01 М PBS (натриев - фосфатен буфер, рН 7 4) 5 за откриване min.Dlya прехвърля в мембранен филтър от протеини в techenie5 - 10 минути. инкубират в разтвор на багрило (0.25% Ponceau-с 40% оцетна киселина, 15% метанол). Предшестващо петно ​​промива 0,01MPBS.Na краен етап преди свързване monoklonalnyhantitel, филтърът се промива с 0.1 М PBS, съдържащ 30% изопропанол (за отстраняване на SDS), 3 х 20 мин., След пет пъти в 0.01 М 0,01MPBS и PBS-0.05% Tween-20. Sorbtsiyuantitel потискат възможно неспецифично филтър чрез инкубиране в разтвор от 1% BSA в 0,01MPBS продължение на 1 час при 37 ° С. C (или една нощ при 4 grad.C). Филтърът се промива с 0.01 М PBS пет пъти, след това 0.1 М PBS-0,05% Tween 20 пет пъти. Накрая, се провежда в rastvoresootvetstvuyuschih антитяло инкубиране в 0.1 М PBS (разреждане избран случай vkazhdom). След инкубиране с мАТ 0,1MPBS филтър се промива 5 пъти и 5 пъти 0,1 PBS-0.05% Tween-20 и се инкубират с peroksidaznymkonyugatom срещу миши Ig G в продължение на 2 часа при 37 ° С. След pyatikratnyhpromyvok 0.1 М PBS и 0.1 М PBS-Tween-20 буфер dlyaokrashivaniya изсипва филтър (12 мг 4-хлоро-1-нафтол се разтваря в 4 мл етанол, обемът се довежда до 20 мл с 0.1 М PBS и се прибавя директно peredprimeneniem 12 мкл от трийсет% водороден пероксид) до ясна проява ivyderzhivayut zon.5.5.4 оцветени. Otsenkabiologicheskiheffektov продукт (и) функциониране vstavki.5.5.4.1 на. Полупрепаративна разпределение протеинови препарати poslefraktsionirovaniya протеинови екстракти двумерен elektroforezom.Dlya polucheniyaotdelnyh пречистен протеин preparatovdvumernym summarnyebelkovyeekstrakty фракционира чрез електрофореза в стандартни условия описани по-горе. След detektsiyubelkovyh фракции се извършва в условия на rastvoromatsetata 4М калиев не-локализиране. Подобни фракции се изрязват 20-40 и събраните парчета gelevyhplastin гелове преди изолирането се съхранява при -20 ° С. Може C.Nekotorye протеини се елуират чрез дифузия. В etihsluchayah получени парчета гелове, съдържащи протеин със същото име, се смила и се хомогенизира в дейонизирана вода, след това се елуира chegobelok в продължение на 15 - 20 мин. хомогенат gelyavstryahivaniem на магнитна бъркалка. След центрофугиране vtechenie 20 минути. при 700 д, супернатантата се събира и процедура sosadkom се повтаря още два пъти. Комбинираният супернатанта (obemokolo 50 мл) се лиофилизира, утайката се разтваря отново в 1-2 mldeionizovannoy студена вода и произвеждат освобождаване от натриев izbytkadodetsilsulfata. Otdelyayuttsentrifugirovaniem утайка (15 мин. При 3000 д), което obespechivaetponizhenie концентрация на SDS в супернатанта на 0.25% [134]. След otostatka соли и SDS разполагат диализа срещу distillirovannoyvody продължение на 12 часа при 4 ° С. poluchayutelektroelyutsiey.Elektroelyutsiyu протеини C.Neelyuiruyuschiesya директно извършват в единицата за фирмата "Bio-Rad" (САЩ) ilianalogichnom оборудване. На пръв употреба dializnoymembrany (доставя се с уреда) го inkubiryut vtechenie 30 минути. в буфер за електрофореза електрод (rastvor2.6) при температура 60 ° С. С фрагменти гел soderzhaschieiskomuyu фракция се поставя в стъклена тръба sdializnoy мембрана и се напълва с електрод буфер dlyaelektroforeza. Тръбата е монтирана в устройството, горната част и се излива nizhnyuyukameru електрофореза буфер, iprotsess свързани електроди извършват една нощ при постоянна сила на тока izrascheta 5 mA на тръба и ограничаване на напрежението. Belokkontsentriruetsya в обем от около 400 мкл буфер rastvorsobirayut това, мембраната се промива, и този разтвор се прибавя на порции kosnovnoy. Протеиновият разтвор след това се диализира протеин чрез метода на Bradford izmeryayutkontsentratsiyu и liofiliziruyut.V работа за определяне razlichnyhrastvorah на концентрация на протеин като се използва метод на Bradford [136]. На база metodalezhit свързване багрило Coomassie брилянтно синьо G-250 sbelkom analizaotbirayut rastvore.Dlya проби (разредени в sluchaeneobhodimosti), съдържащ 1 - 10 г протеин в 0.1 мл. Към 25 mklobraztsa прибавят 25 л разтвор, съдържащ 0.05% багрило Coomassie брилянтно синьо G-250, 5% етанол, 10% ortofosfornoykisloty и абсорбцията при 594 нм. Belkaopredelyayut концентрация от калибрационната крива построена за rastvorabychego серумен албумин ("Serva".5.5.4.2). Тестване на биологичните свойства на клетъчна култура вмъква produktafunktsionirovaniya cheloveka.Dlya проверка на биологичните свойства на продукта funktsionirovaniyavstavki използва тест - системи, базирани на култури от човешки фибробласти postnatalnyhdiploidnyh получен, както е описано [137] .Kultivirovanie клетки се провежда в DMEM среда (произведена от "PanEco", RF), допълнена с 5% серум голям rogatogoskota и 5% човешки серум, кръв от пъпната връв (произведен от "PanEco", Руска федерация), като се използва или стъклени флакони Карел или plastikovyeodnorazovye твърди матраци "Costar" (Холандия) или в 96-lunochnyeplanshety фирма "Nunc" (Дания). Като органичен krasiteleyprimenyayut жизненоважно багрило, метиленово синьо [138] и krasitelGimza [139] (фирма "Merck"Германия) .От първия етап се намира в зависимост kolichestvomkletok между отвора и интензивността на оцветяване с метиленово синьо, dlyachego клетки се посяват при различни плътности в 96-ямкова planshetyi култивират в продължение на 1 ден при 37 ° С. С Следваща kletkiprizhiznenno оцветява в продължение на 1 час с метиленово синьо, и vkazhduyu прибавяне на 25 ул от разтвор багрило. След това се оцветяват kletkidvazhdy промива с вода и се суши на въздух. материал плътност Izmerenieopticheskoy отвор извършва на electrophotometer"Ефос 9305" (фирма, "Ефос", Русия) при 594 нм. Резултати opredeleniyaopticheskoy плътност и размер на засява на гнездо kletokobrabatyvayut от компютърна програма "SigmaPlot" ilianalogichnyh компютър programm.Pri изучаване на ефекта на операцията по поставяне на способността на продукта naproliferativnuyu на човешки фибробласти на клетки, растящи в 96-ямкови плаки, се добавят различни kolichestvapreparata на протеина и след 4 дни на културата probyokrashivayut метиленово синьо, както е описано по-горе. Паралелно vseproby mikroskopiruyut (MBI-3 LOMO adaptirovannyykakinvertirovanny микроскоп с помощта на специална дюза) dlyaotsenki морфологичен състояние на отглеждане kletok.Pered Giemsa оцветяване raznoyplotnosti клетъчна суспензия в DMEM среда с 10% фетален телешки серум vobeme 200 л добавен към ямките на 96-ямкови плаки. Така pervyyvertikalny брой дупки се контролира, не е zapolnyayutkletochnoy окачване. Плаките се инкубират в атмосфера с 5 protsentnogouglekislogo газ при температура от 37 ° С. След един дни kletkifiksiruyut прибавяне към всяка ямка на 50 мкл holodnogosvezheprigotovlennogo 2.5% глутаралдехид. Cherez30 минути. определяне при 4 ° С. C се отстранява от държача на кладенци, lunkidvazhdy промива с студен разтвор на Hank и Giemsa mklkrasitelya запълни 100, специфично свързване с хроматин разрежда 1:50 преди употреба. Kletkiinkubiruyut багрило 3 часа при 37 ° С. Krasiteludalyayut С. След това ямките се промиват два пъти с разтвор на Hanks, изпълнен 100mkl елуиране разтвор (0.1 М NaH2PO4: С2Н5ОН - 1: 1) iinkubiruyut при стайна температура в продължение на 15 минути. когато nepreryvnomperemeshivanii. Измерване на абсорбцията при елуиране фотометър rastvoraprovodyat "Ефос 9305" при дължина на вълната 620 nm.6. Оценка на хранителни продукти, poluchennoyiz генетично модифицирани източници на функционално - технологични svoystvam6.1. Необходимостта от всички изследвания porazdelu 6 се определя от експерт на Москва gosudarstvennogouniversiteta приложна биотехнология на Министерството на образованието на Руската генерала iprofessionalnogo Federatsii.6.2. Животът на човека organizmaglavenstvuyuschuyu протеин играе роля, поне така изглежда vazhnymprosledit, ако тя не претърпява промяна в protsessegeneticheskoy модификации като mozhetprivesti генното инженерство да се промени структурата и функцията на протеини, белтъчини chastnostifermentov.Svoystva уникално свързано с неговата структура. Osnovnymmetodomissledovaniyastrukturybelkayavlyaetsyametodrentgenostrukturnogoanaliza неговите кристали. Въпреки това, за по-голямата част на протеините, използвани в хранителните данни за техните strukturepo няколко причини неизвестни. От друга страна, известно е, chtostruktura протеини също определя техните термодинамични свойства, които на свой ред влияят техните функционални svoystva.Suschestvuet брой методи за измерване термодинамични свойства, сред които предпочитан метод е калориметрия. Etotmetod дава възможност за измерване на температурната зависимост на teploemkosti.Iz ​​получава зависимост може да се изчисли dlyanativnoy топлинния капацитет и денатурирани форми на протеина, и протеин temperaturudenaturatsii енталпия. Изчислената термодинамична parametrypozvolyayut определи неразделна хидрофобност и konformatsionnuyustabilnost протеини [38 - 40]. Тези характеристики tesnosvyazany с основните функционални свойства [41 - 44] .Metod йон сдвояване фази HPLC vobraschennyh позволява идентификация единица zamenyaminokislotnyh остатъци в макромолекулата на протеини и незаменими prisravnitelnom проучване протеини [44] .В процеса на промяна на генома на организма него nakaplivayutsyakomponenty, obespechivayuschieegoustoychivost фактори vneshnimneblagopriyatnym - болести, насекоми - вредители хербицид и т.н. В определени концентрации, те komponentymogut бъде опасно за здравето на човека, се използва в pischuprodukty произведени чрез използване на генетични методи inzhenerii.Poetomu при промишлената обработка на суровини такива mogutpotrebovatsya промени в съществуващите технологии, obespechivayuschieminimalnoe остатъчен opasnyhdlyazdorovyakomponentov. Такива промени в технологията могат да повлияят nakachestvennyh показатели (функционално -tehnologicheskihsvoystvah) протеинови препарати, получени от този geneticheskimodifitsirovannogosyrya.Krome, predpolagaetsyatselenapravlennoe променя състава на аминокиселината на протеини, извлечени от генетично модифицирани хранителни продукти (например, като балансирано ACN), за да се повиши тяхната pischevoytsennosti. Това неминуемо ще доведе до промени в функционалните свойства на търговските -technological протеинови препарати iotrazitsya качеството на хранителните продукти, в които oniispolzuyutsya. Това, от своя страна, може да доведе до промени в neobhodimostivneseniya процеси с помощта etipreparaty. Следователно, непрекъснат контрол (мониторинг) на свойствата на протеинови препарати, получени от храни суровина когато geneticheskimodifitsirovannogo сигурност bezopasnomsoderzhanii компоненти вредни cheloveka.Mikro- протеин и макро-молекули определя ryadnaibolee важни функционални свойства на протеина, като kakrastvorimost, способността за стабилизиране на емулсии и пени образуват гелове запазват мазнини и влага [9-13] .Тези функционални свойства са пряко свързани skharakteristikami завърши хранителни продукти. + ----------------------- + ------------------------- --------------- + | функционални свойства | Ефект върху характеристиките на крайния || | Каталог | + ----------------------- + ----------------------- ----------------- + | рН на водна суспензия | характеристика протеин preparatov- || | Определя фундаменталната възможността || | Използване на протеиновото лекарство в || | Особен тип продукт | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | Разтворимост | се използва като основен pokaza- || | От Tell-качествени протеини preparatov- || | Предизвиква реологични свойства || | Съдържащи белтък хранителни системи, устойчиво || | Нес емулсии стабилизирани с Белгород || | Com zhirouderzhivayuschuyu способност belko- || | О препарати | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + | реологичните свойства | определяне на нивото на приемане на лекарството || водни дисперсии | продукт, който осигурява исканата || | Комплексни реологични свойства на готовия || | Каталог засяга гуни на материалната || | Потоци в процеса | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | задържане на вода и | влияят върху нивото на въвеждане на продукт || zhirouderzhivayuschaya | протеинови препарати, осигуряващи || капацитет | намаляване на загубите в процеса || | Преработен (варени и пържени), униформа || | Съвместимост на продукти, намаляване на брак || | Резултат от отделяне на вода и мазнини, || | Продукти за намаляване на силата на звука | + ----------------------- + -------------------- -------------------- + | критична концентрация | определя нивото на въвеждането на продукта || ТА гел | протеинови препарати, осигуряващи || | Задължително комплекс структурна - механична || | Готворителни свойства на крайния продукт | + ----------------------- + ------------------- --------------------- + | емулсия | определя нивото на въвеждане на стабилността на продукта || | протеинови препарати, осигуряващи || | Получаване на стабилни мастни емулсии, || | Предотвратява отделянето на мазнини в процеса || | Processing | + ----------------------- + --------------------- ------------------- + понастоящем няма стандартизиран metodyopredeleniya функционални свойства и резултатите от измерването dolzhnynosit сравнителен характер по отношение на лекарства ilikommercheskim продукти, произведени от nemodifitsirovannogopischevogo методи syrya.Osnovnye за определяне на функционалния preparatovprivedeny свойства в следната таблица. -------------------------- + ---------------- + -------- + ------------ + | индекс | Метод за определяне | Литературно || || източник | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | 1 | 2 | 3 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | състав идентификационни | хистологични методи | 51 || продукти ||| + ----------------- --------- + ------------------------ + ------------ + | Разтворимост | спектрофотометър | 50 | + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | задържане на вода | метод центрофугиране | 46 || способност ||| + --------------- ----------- + ------------ + ------------------------ + | стабилност емулсия | метод центрофугиране | 47 | + -------------------------- + ------------- ----------- + ------------ + | критичната концентрация | термотропен метод | 48 || гел | гел + --------- || ----------------- ------- + ------------------------ + ----- + | Zhirouderzhivayuschaya FPIC B- | метод центрофугиране | 49 || Nosta ||| + -------------------------- + --------- --------------- + ------------ + | структурен | микрокалориметрия | 38-40 || стабилност ||| + ------ -------------------- + ------------------------ + ---- -------- + | Идентификация на амино на | йон-свързване метода HPLC | 45 || остатъци ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | термодинамичните свойства | диференциален метод | 39 || | сканиране microcalorimeters ||| | Калориметър || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Интеграл хидрофобност | микрокалориметрия | 40, 41, 42, || || 43 44 | + -------------------------- + ---------------- -------- + ------------ + | реологични свойства | Вискозиметрия | 52 || водни дисперсии ||| + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | Аминокиселинният състав | HPLC | 45 | + -------------------------- + ------------ ------------ + ------------ + | органолептичните свойства | Qualimetry | 53 || мазнини: цвят, мирис, прозрачност |||| ||| + + -------------------------- ----------------------- - + ------------ + | индекс на пречупване | РЕФРАКТОМЕТЪР | 53 | + -------------------------- + ------------------------ + ------------ + | мазнини Тегло | дензитометрия, | 53 || | Гравиметрия || + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Вискозитет мазнини | Вискозиметрия | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | мастни - киселина състав | GC | 53 | + -------------------------- + ------------------ ------ + ------------ + | Йодночисло | обема н | 53 | + --------------------- ----- + ------------------------ + ------------ + | Acid стойност | обема н | 53 | + -------------------------- + -------------------- ---- + ------------ + | брой на осапунване | обема н | 53 | + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | температура желатинизация | Вискозиметрия | 54 | | нишесте ||| + -------------------------- + ----------------- ------- + ------------ + | размер на зърна нишесте | Оптичната микроскопия | 54 | + ------------- ------------------------ ------------- + ----------- + - + | задържане на вода | Gravity | 54 || способност нишесте ||| + -------------------------- + ------- ----------------- + ------------ + | реологични свойства | Вискозиметрия | 54 || водни дисперсии нишесте ||| + --- ----------------------- ------------------------ + + - ----------- + | Подуване нишесте | Оптичната микроскопия | 54 || зърна ||| + ----------------------- --- + ------------------------ + ------------ + | критичната концентрация | метод термотропен | 54 || желиращи нишесте | желиращ || + -------------------------- + -------------- ---------- + ------------ + | амилоза | спектрофотометър | 54 || амилопектин ||| + ----------- --------------- + ------------------------ + ------------ + 7. мен 
Споделяне в социалните мрежи: 

сроден

© 2011—2022 GuruHealthInfo.com