Кръв радиоимуноанализ (RIA) прилагане

През 1956 г. за първи път са открити при пациенти, лекувани с инсулин, nepretsipitiruyuschie антитела, способни на свързване ¹³¹I-инсулин. След това, тези изследвания група показа, че небелязан инсулин конкурира с белязано антитяло за свързване към и го измества от имунните комплекси. Впоследствие Berson и Yalow разработен първия метод за измерване RIA на концентрация на инсулин в серума, за които те получиха Нобелова награда. При този метод, инсулин, свързан с антителата се отделя от несвързаната инсулин от хартия електрофореза. Приблизително по същото време, през 1960-те., Grodsky и Forsham описват подобен метод с помощта на АПИ ¹³¹I-инсулин, но отделянето на свързания и несвързания хормон, те се използва вместо осоляване електрофореза.

Един огромен принос за развитието на RIA Хейлз и Randle направен през 1963 г. за разделяне на свързан и несвързан хормон те използва анти-у-глобулин, така наречените вторични антитела. Този подход се основава на работата Skom и Talmadge, който през 1958 г. показа, че вторични антитела предизвика утаяване на комплекси "антиген-първично антитяло." Хейлз и метод Randle, наречен "метод на двойно антитяло", се оказа много по-чувствителен и специфичен от предишни версии на RIA.

През 1963, Herbert и сътр. Ние разработихме техника за разделяне комплекси "антиген-антитяло" от несвързания антиген от активен въглен, покрит с декстран. Методът се основава на свойството на въглен декстран смес по същество мигновено абсорбира свободен антиген без да се свързват с антиген-антитяло комплекси. Тази техника позволява да се разделят на имунни комплекси много byst7 yardarm от техники pretsipitatsionnye, така че можете да го използвате ¹³¹I антигени с ниска специфична активност белязани от Hunter и Greenwood.

Видео: Научи карикатура Winx?

В същото време Utiger и сътр. разширен спектър на приложение RIA, разработването на метод за количествено определяне на човешки растежен хормон. По-късно Greenwood и сътр. прилага метод на йодиране STH, което позволява да се получи белязан хормон със специфична активност от 200- 500 MCI / мг (6000-9000 Ci / ммол).

Тази техника се използва и днес. Същността се състои в това, че йод изотоп (1311 или 1251) в състава на натриев йодид се окислява чрез хлорамин Т и в тази форма замества един или повече водородни атоми във фениловия пръстен на тирозин и хистидин имидазолов пръстен. След 1 мин, реакционната смес се добавя редуциращ агент, за да се избегне ненужно увреждане на хормона. Имайте предвид, че принципът на оксидативния йодиране на протеини е описано в Hughes 1957 В допълнително Meyer Knobil и разработен за измерване на RIA маймунски и човешки растежен хормон, характеризиращ се с активен въглен, използван за разделяне на несвързания хормон.

Произход RIA за измерване на нива на гонадотропните хормони (в този случай - LH), разработен през 1966 г., на базата на използването на антитела към човешки CG, тъй като рано беше показано, че тези антитела се свързват с човешки и LH. Един от експериментите в тази област е направила истинска революция в имунохимия: живътн и др. Открихме, че антитела са в състояние да се придържат към дискове на деазотизирана полистирол. По този начин се елиминира необходимостта от разделяне на комплекси антиген-антитяло комплекс чрез утаяване или адсорбция. По-късно живътн и сътр. научи имобилизирано антитяло директно с ненаситен полистирол в алкална среда. Резултатите от тези проучвания са послужили като основа за създаването на ELISA (вж. По-долу). Faiman и Райън за първи път успя да се антисерум да гонадотропин хипофизната - човешки LH. Впоследствие RIA за определяне на LH на плъх са разработени.

Развитие на АПИ за измерване на нивата на FSH, както е в случая с LH, започнете с едно око на бъдещата клинични изследвания. През 1967 и 1968. няколко изследователски групи съобщават за нови методи на АПИ за различни форми на човешки FSH. Всички те се основават на метода на двойни антитела.

През 1967 г., Aria и Лий за първи път обяви, метод за определяне на пролактина, въз основа на метода на двойни антитела. Първият измерване на нивата на пролактин от RIA са проведени в отсъствието на човешки материал при овцете и говедата плазма.

Теоретичните основи на АПИ

Първите методи RIA (например, методи за Berson и Yalow или Grodsky и Forsham) се основават на феномена на конкурентно инхибиране. Това явление се състои във факта, че свързването на изотопно белязан хормон (индикаторния антиген) със специфични антитела инхибират в присъствието на небелязан хормон (немаркиран антиген). Феноменът на конкурентно инхибиране може да бъде описан от две уравнения: "белязан антиген + антитяло комплекс белязано" и "немаркиран антиген + антитяло <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Обикновено RIA извършва при 4 или 37 ° С във фосфатно-буфериран физиологичен разтвор при рН 7 или 8. Реакцията може да продължи от 2 до 24 часа (в зависимост от афинитета на антитялото и желаното ниво на чувствителност). Имайте предвид, че автоматизация на анализ и подобрени методи за производство на антитела, значително намалява времето на реакцията. Когато реакционната смес се установява равновесие, антиген-антитяло комплекси се разделят чрез утаяване с вторични антитела, антигени и абсорбция на свободни антитела върху активен въглен или утаяване в среда с висока плътност, такива като полиетилен гликол. Ако твърда фаза RIA, инкубационната среда се отстранява и просто антиген-антитяло комплекси остават върху полистирен или друга твърда фаза. В последната стъпка на радиоактивност комплекси. Ако хормонът е сигнализирано ¹²⁵аз или ¹³¹I, като се използва за борба с радиация ако етикетът служи 3H, частици с помощта на сцинтилационен брояч. концентрация хормон в проби се изчислява от калибрационната крива получава от измервания в стандартни проби с известни концентрации на хормона.

Получаване на антитела

Поликлонално антитяло се получава чрез имунизиране RIA антиген (хормон) животни от различни видове, включително и зайци, пилета, морски свинчета, патици, овце и кози. За първично антитяло (анти-хормон) обикновено се използва в зайци и морски свинчета за вторично антитяло (анти-първична) - овце и кози.

Видео: Алергии към куче пудел порода

Има много методи за имунизация, най-често - инжектирането антиген в лапата или в регионалните лимфни възли или далака. Тъй като в приемащата съществуват антигени за кратко време, за надеждно предизвикване на имунен отговор, като се използва адювант на Freund. Неимуногенни антигени с ниско молекулно тегло (например стероидни хормони) и антигени с ниска имуногенност, преди имунизация прикрепен към големи молекули или частици (метилиран албумин, феритин, декстран, Sephadex и т. П.). Имунизацията обикновено се извършва на няколко етапа с интервали от 2 седмици. Обикновено, след няколко инжекции с титър на антитялото в серума бързо нараства. Кръв за имунен серум, взета от кухините на сърцето или на вените и артериите на ухото. Последният метод се използва най-често в зайци. Полученият серум се инкубира 30 минути при 57 ° С за унищожаване на комплемента. След това серумът се добавя консервант за предотвратяване на растежа на бактерии и гъби (натриев азид или тримерозал).

моноклонални антитела

През 1975 г., Kohler и Milstein разработена принципно нова - хибридомна - технология за производството на антитела. По-късно, това развитие е удостоен с Нобелова награда. Ние описваме основните елементи на тази технология.

Мишки и плъхове се имунизират с антиген, като хормон. Когато антитяло титър в серума получава достатъчно високо в имунните животни от село Zenk изолиран плазмени клетки, между които има клетките - производители на антитела срещу първоначалния антиген. Плазмените клетки ин витро хибридизира миеломни клетки, получени животно от същия вид. Клетъчната суспензия се пренася в среда за селекция, в които само хибридни клетки оцеляват и плазмени и Най миеломни клетки загиват. Хибридни престои един посяват в ямките на солна среда захранващото където те се разделят и образуват хибридоми (обезсмъртени клетъчни линии). Сред множеството изберете тези хибридоми, които продуцират антитела от желания антиген и се размножават им хранителна среда или в перитонеалната кухина на сингенни мишки. От pitatelno- среда или асцитна течност изолирано антитяло. Тези антитела се наричат ​​моноклонално защото те са произведени от хибридома са потомци на един плазмени клетки. Моноклонални антитела, продуцирани от хибридома, разпознават само един епитоп на антиген. Това е основната разлика между моноклоналните антитела от поликлонален антисерум, който обикновено съдържа няколко различни антитела срещу различни детерминанти на антигена.

Един от най-важните предимства на моноклонално антитяло към поликлонални крие във факта, че един и същи тип на моноклонални антитела с определена специфичност и афинитет могат да бъдат произведени в количество, и почти безкраен (като безсмъртни хибридомни). За разлика от състав на антитяло на поликлонални антисеруми е много променлива, която трябва да се проверява всяка нова партида антисерум и подбор на условията за неговото прилагане. По този начин, използването на моноклонални антитела, много по-лесно да се стандартизира АПИ и други имуно тестове.

Първи хормони, радиомаркирани

Както вече бе споменато, за йодиране на протеинови хормони, най-често се използва метод, предложен от Greenwood и Hunter. Първоначално тя се използва като етикет ¹³¹I, но поради краткото време на полуживот на този изотоп (8 дни) срокът на годност на етикет хормон беше малък. През 1967 г. Wilde и сътр. използвана за йодиране ¹²⁵I (T_1/2 = 60 дни). Оттогава изотоп използва за маркиране на всеки протеин, а някои не-протеинови хормони. Така получен белязани хормони със специфична активност от 100-250 MCI / мг. Това е достатъчно за надеждно откриване на частици в радиация брояча.

За обозначаване на небелтъчен използване хормон и други радиоактивни изотопи, такива като радиатори частици ³Н или ¹⁴С белязан ³Н или ¹⁴С стероиди се използват не само в имунохимичен анализ на хормони, но също така и в основните ендокринологични проучвания, например за изследване на локализацията на стероидни рецептори в различни клетки и тъкани на опитните животни.