Не-изотопни методи за имуноанализ на хормони

Това беше първият метод за точно количествено определяне на хормони, е широко използван и изигра огромна роля в лабораторна диагностика на ендокринни заболявания. Тя се основава на съвременни принципи формират RIA за имунологично хормони. Въпреки това, през последните двадесет години, предаде РИА е почти напълно елиминирана от клиничната практика на не-изотопни методи на имунологичен тест - ELISA и анализ immunohemilyuminestsentnym. В основата на тези методи, както и в RIA основава на взаимодействието на антигени и антитела, но се използват като етикета нерадиоактивни изотопи и ензими, които катализират реакция да се образува оцветен продукт, или луминесцентно вещество. В първия случай, крайният етап на анализ на оптичната плътност на реакционната смес във втория - на броя на фотоните, излъчвани от луминесцентно вещество.

Видео: Регионална лаборатория диагностичен център иму методи на изследване IHMI

свързан имуносорбентен анализ

За количествено определяне на хормони, най-често се използва твърдо фазов ELISA с две антитела. Тя се провежда в мулти-ямкови пластмасови плаки. В долната част на гнездата сорбира моноклонални антитела, специфични за дадена антигенна детерминанта хормон. Ямките бяха серумни проби с известни концентрации на хормоните или стандартни проби с известни концентрации на хормона. Плаката се инкубира в продължение на 30-120 минути, този път, хормон молекули успяват да се свърже с антитела, адсорбирани върху пластмаса. След инкубиране, ямките се промиват с буфер за отстраняване на несвързаната хормон и други серумни компоненти. След това ямките правят поликлонални антитела към хормона, конюгиран с пероксидаза (т.нар конюгат), и плаката се инкубира в продължение на 15-30 минути. Където молекулата на конюгат се свързва с молекулите на хормон. Кладенчетата отново се промиват за отстраняване на несвързания конюгат и се прибавят към разтвор, съдържащ им безцветно пероксидаза субстрат. Peroxidase превръща субстрата в оцветен продукт. Интензивността на оцветяване разтвори в ямките (тя се измерва в фотометър) е директно пропорционален на количеството на конюгата в кладенеца, и това е - концентрация хормон. концентрация хормон в серумни проби се изчислява от калибрационната крива получава чрез измерване на концентрациите на хормоните на стандартни проби.

Трябва да се подчертае, че този метод ELISA, за разлика от по-горе описаните методи RIA, е неконкурентоспособна. Фактът, че в реакционната смес при липсата на белязан антиген и на нивото на свързване на поликлонални антитела (конюгирани) с антиген, адсорбиран на моноклоналните антитела зависи от концентрацията на антиген в пробата. Несъстезателни методи се използват и когато immunohemilyuminestsentnom анализ.

Immunohemilyuminestsentny анализ

Има много възможности immunohemilyuminestsentnogo анализ. Ще опишем едно примерно изпълнение, което се използва за измерване на нивата на гонадотропини в съвременната автоанализатор. В това изпълнение, хормонът се използва за свързване на парамагнитни микрочастици, покрити с моноклонално антитяло силно специфичен към даден хормон. Микрочастиците се суспендират в буферен разтвор и се добавят към суспензия от серумни проби или стандартни проби. След кратко инкубиране (10- 20 минути) микрочастици със свързания хормон се утаяват в магнитно поле и се промиват няколко пъти. След това микрочастичките се суспендират отново в буфер и се добавя към суспензия на поликлонални антитела на хормон, конюгиран с алкална фосфатаза. След промиване несвързаният конюгат се прибавя към суспензия от микрочастици dioksetina фосфат. Под действието на алкална фосфатаза фосфат dioksetina образува dioksetin излъчващи луминисцентни лъчи. Интензитетът на луминесценция, която се измерва от фотоумножител, е директно пропорционална на концентрацията на хормона в пробата.

Видео: Лабораторни изследвания

Методи за откриване на автоантитела

Репродуктивни нарушения може да бъде пряко или косвено причинени от автоимунни патологии. Например, мъжки стерилитет може да бъде причинено от автоимунен отговор срещу сперматозоидите и в патогенезата на безплодие при жените може да играе ролята на автоимунно заболяване на щитовидната жлеза или надбъбречните жлези. Маркери на автоимунни патологии са автоантитела. За откриване на серумни автоантитела (например, антифосфолипидни антитела, антитела към yodidperoksidaze или 21-хидроксилаза) използва метод immunohemilyuminestsentny анализ и индиректна имунофлуоресценция ELISA. В последния случай, като антигенен субстрата използване криостатни срези тъкан, срещу което автоимунната реакция е насочена. За откриване на сперматозоиди антитела в спермата и метод цервикална слуз микроаглутиниране използвани с латексови частици, покрити с антитела срещу IgA или IgG.

други методи

За някои хормони, като катехоламини и серотонин, не е лесно да се установят надеждни методи за имунологичен анализ. Фактът, че тези материали имат много ниско молекулно тегло и срещу тях е трудно да се получи високо специфични първични антитела, моноклонални дори. Подобни проблеми възникват при разработването на методи за имунохимичен анализ на стероидни хормони и техните производни (поради високата вероятността за кръстосана реакция с различни първични антитела стероиди имат голяма антигенна сходство). Следователно, за точен количествен анализ на такива агенти в последните години все повече използва високо течна хроматография, последвано от мас-спектрометрия.

Често, ендокринни заболявания, включително и репродуктивни нарушения, не са причинени от патологични изменения в нивото на гонадотропин и половите хормони и техните рецептори мутации. За оценка на рецепторната функция преди използва биологични тестове ин витро: пациентът се биопсия тъкан, която е обект на хормона, биопсии се поставят в хранителна среда се добавя към средата и оценени хормон тъкан отговор на този хормон. Днес рецепторни мутации, открити чрез определяне на ДНК последователността на нуклеотиди в съответните гени. ДНК за такива анализи обикновено се получават от лимфоцити от пациенти.