Лабораторна диагностика на инфекциозни заболявания

Общи видове анализи включват микроскопия, тест култура, имунологични тестове (анализи на аглутинация, като латекс аглутинация, ензимен имуноанализ, Western Blot, утаяване тестове и тестове за свързване на комплемента) и методи за идентифициране на нуклеинови и не-нуклеинови киселини. Обикновено култура теста - е златен стандарт за идентифициране на микроорганизми, но резултатите не могат да бъдат на разположение за дни или седмици. В допълнение, патогени могат да бъдат изолирани в култура, което ги прави полезни алтернативни тестове. Когато патоген извършва тест култура, и се идентифицира, лабораторията може също да се оцени чувствителността към антибиотици.

Някои тестове (например, Грам оцветяване, обичайната аеробна култура) могат да открият голямо разнообразие от патогени. В същото време, някои патогени не могат да бъдат идентифицирани в анализа. Поради това, клиницистите трябва да са наясно с ограниченията на всеки тест за специфични микроорганизми. В такива случаи, лекарите трябва да попитате за тестове, които са специфични за заподозрян патогена (например, специални багрила или среда за култура) или препоръчват някои лабораторни тестове, за да изберете.

микроскопия

Микроскопия може да се направи бързо, но точността зависи от опита на лабораторията работника и качеството на оборудването. Инструкции често ограничават използването на лекарите микроскопия за диагностични цели е сертифицирана лаборатория.

Повечето екземпляри, третирани с бои, че цветните патогени, които ги прави се открояват от тълпата, въпреки че те могат да се използват влажни препарати неоцветени проби за откриване на гъбички, паразити, информационни клетки от влагалището, мобилни организми (например, Trichomonas) и сифилис (микроскопия, Darkfield ). Откриване на гъби може да бъде подобрена чрез използване на 10% калиев хидроксид за разтваряне на заобикалящата тъкан и не-гъбични организми.

Лекарят поискал живопис на основата на вероятните патогени, но не и оцветяване не е 100% специфичен. Повечето от пробите, обработени от грам оцветяване, и ако се подозира, микобактерии, киселинно-оцветяване. Въпреки това, някои патогени са трудно забележими, когато използвате тези методи. В такива случаи изискват различни версии на оцветяване или други методи за идентификация. Тъй като микроскопични откриване микроб обикновено изисква концентрация от около 1h105 / мл, повечето проби от биологични течности (например, CSF), концентрирани (например, чрез центрофугиране) преди анализ.

Грам оцветяване. Оцветяване по Грам бактерии класифицира според това дали те запазват кристално виолетово петно ​​(грам-положителни - синьо) или не (грам - червено). В допълнение, той показва клетъчната морфология (например бацили, коки) и организацията (например, клъстер верига диплоиди). Тези характеристики могат да помогнат в предварителен подбор на антибиотици, докато чака окончателното идентифициране. За да се получи оцветяване по Грам, лабораторни материал се нагрява и фиксирани образец на плъзгача и след това оцветени последователно с оцветяване по Грам лилаво, йод, ацетон и контрастен багрило (обикновено Сафранинът).

Киселина и умерени (модифицирани) киселинни багрила. Такива багрила се използват за идентифициране на киселинно-устойчиви организми (Mycobacterium Sp.) И умерено киселинно-устойчиви организми (особено Nocardia Sp.). Тези багрила са полезни също за оцветяване на рода Rhodococcus и други подобни, както и ооцистите на някои паразити (например, Cryptosporidium).

Въпреки откриване на микобактерии в храчки изисква само около 5 000-10 000 микроорганизми / мл, микобактерии често присъстват в човешкото тяло, по-ниските нива, така че чувствителността е ограничен. Обикновено няколко мл храчки деактивиране на натриев хидроксид и се концентрира чрез центрофугиране в продължение на киселина оцветяване. Това подобрява диагностицирането, въпреки че някои умерено киселинно-устойчиви организми са трудни да се разграничат от микобактерии.

флуоресцентно оцветяване. Такива багрила позволяват откриване на патогени при по-ниски концентрации (1x10⁴ клетки / мл). Примери - акридин оранж (бактерии и гъбички), ауламин родамин и ауламин О (микобактерии) и kalkoflyuor бял (гъби, особено дерматофити).

Съединение с флуоресцентно багрило с антитяло, насочено към патогена (директен или индиректен имунофлуоресцентен) увеличава чувствителността и специфичността на диагноза. Въпреки това, тези анализи са трудни за четене и тълкуване и няколко (например, анализи за директно флуоресценция и Pneumocystis Legionella антитела) са налични в търговската мрежа и обикновено се използват.

оцветяване мастило. Това багрило се използва за откриване главно Cryptococcus neoformans и други скрити гъби в суспензия на промити клетки (например, CSF утайка). Цветни вторичен домейн и не самото тяло, което прави възможно да се види всяка капсула в тялото като хало. За други патогени тест не е чувствителен като откриване на криптококов антиген. Специфичността на метода също е ограничена: бели кръвни клетки могат да се появят скрити патогени.

Wright оцветяване и Giemsa. Такива багрила се използват за откриване на паразити в кръвта, Histoplasma capsulatum фагоцити и тъканни клетки, вътреклетъчни включвания образувани вируси и Chlamydia трофозоити на Pneumocystis jirovecii и някои вътреклетъчни бактерии.

Трихромни оцветяване (оцветяване Gomori - Wheatley) и желязо хематоксилин оцветяване. Тези багрила са използвани за откриване на чревната протозои.

Боядисват Gomory - Уитли се използва за откриване микроспоридии. Той не може да разкрие яйца от хелминти и не lichinki- надеждно идентифициране на Cryptosporidium. Fungi и човешки клетки също се оцветяват.

Iron хематоксилин оцвети диференцираните клетки, активира клетки и ядра. глист яйца могат да бъдат боядисани в тъмен цвят, което го прави трудно да се определи.

култура

Тест култура - микробен растеж върху твърд или течен хранителен увеличение средата на броя на организмите улеснява идентификация. Културата също улеснява тестване антибиотик чувствителност.

Видео: Диагностика на цистит. Част 3 052-2506596

Комуникация с лабораторията е важно. Въпреки че повечето от материала на пробата покритие на общо предназначение среда (например, кръв или шоколадов агар), някои патогени изискват включването на определени хранителни вещества и инхибитори или други специални usloviy- ако се подозира един от тези патогени или ако пациентът получи антибиотици, е необходимо докладва на лабораторията. За източник на доклада за проба тези данни до лабораторията могат да се диференцират патогени от нормалната флора.

Вземане на проби е важно. Грешен тип тампон може да доведе до фалшиво-отрицателни резултати. Дървени пръчки за пръти намазка токсични за някои вируси. Пръчици с тампон върха на памук токсичен за някои бактерии и хламидия. Кръвните култури изискват обеззаразяване и дезинфекция на кожата (например, повидон йод тампони се оставят да изсъхнат и се отстранява с 70% алкохол). Често използвани множество проби, всяка от отделен ограда mesta- предпочитане се извършва на височината на треската, ако е възможно. Нормалната флора на кожата и лигавиците, което расте дори в същата кръвна проба, третирани като заразен. Ако кръвна проба се получава от централна вена или артерия, периферна кръвна проба трябва да бъдат взети, за да се диференцират системен бактеремия от катетър инфекция. Културата на заразените катетри обикновено стане положителен по-бързо и съдържа повече организми от двете комбинирани култури от периферна кръв. Някои гъби, по-специално на почвата (например Aspergillus сп.), Обикновено не може да бъде култивирана от кръвни проби.

Пробата трябва бързо да се транспортират в подходяща среда и при условия, които ограничават растежа на други потенциално инфектиращи флора. За точно определяне на размера на патоген да се предотврати растежа инфлуенца допълнителни копия трябва да бъдат незабавно транспортирани до лабораторията или, ако транспортирането се забави, се поставят в хладилник (в повечето случаи).

Има специални условия за определени култури.

Анаеробни бактерии не трябва да бъдат изследвани в тестова култура, като диференциация на патогени от нормалната флора често е невъзможно. Проби проби трябва да бъдат защитени от въздух. анаеробни транспортни носители се използват за четката. Проби проби, събрани с помощта на спринцовка (например, съдържанието абсцес) трябва да бъдат транспортирани в спринцовката.

Микобактерии са трудни да се култивира. Пробите, съдържащи нормалната флора (например, слюнка), първо трябва да се изключат и се концентрират. Mycobacterium туберкулоза и някои други микобактерии расте бавно. Растеж на М. туберкулоза, са склонни да се появяват по-бързо в течности, отколкото в твърда среда. Обикновено, използването на автоматизирани системи с течната среда може да се увеличи в рамките на 2 седмици, в сравнение с >4 седмици на твърда среда (агар Lowenstein - Jensen). В допълнение, малко на брой организми може да присъства в копието. Ограда няколко екземпляра на едно и също място може да помогне да увеличи вероятността от откриване на патоген. По време на 8 седмици не трябва да се смесва инокулира среда. Ако има съмнения, нетипичен микробактериален, той трябва да уведоми в лабораторията.

Вирусите обикновено култивирани на намазки и тъканни проби, обикновено транспортират в среди, които съдържат антибактериални и противогъбични агенти. Съдържанието на пробите инокулират проби в тъканна култура, които подпомагат растежа на вируса и инхибират всички други микроби. Вирусите са много нестабилни (например зостер вирус) са инокулирани в култура тъкан рамките на 1 час на събиране. Стандартна тъканна култура е най-чувствителни. Express тъканна култура клетки (плака метод: броене петна върху клетъчния монослой) могат да осигурят по-бързо, но показателни за резултатите. Някои общи вируси не могат да бъдат открити с помощта на конвенционални методи за култивиране tkaney- изискват алтернативни методи за диагностика.

Проби, получени от гъбички нестерилни обекти трябва да се инокулират в среда, съдържаща антибактериален агент. Случаите трябва да се съхраняват в продължение на 4 седмици преди изхвърляне.

Анализ на чувствителността

Чувствителност анализи определи устойчивост към антибиотици микроби от излагане на стандартизирана концентрация на антибактериални лекарства. Анализ на чувствителността може да се проведе за бактерии, гъбички и вируси. За някои организми, получени от едно лекарство резултатите да прогнозират резултатите от такива лекарства. По този начин, не всички потенциално активни лекарства са тествани.

Анализ чувствителност се извършва ин витро и може да не се вземат предвид редица фактори естествени условия (например, фармакокинетиката и фармакодинамиката, функция на концентрацията на лекарството в някои тъкани и органи на човешкото тяло имунната система), които оказват влияние върху успеха на лечението. По този начин, резултатите от изпитването на чувствителността не винаги прогнозират резултатите от лечението.

Анализ чувствителност може да бъде качествено, полуколичествена или с използване на методи за изолиране на нуклеинови киселини. Анализ може също да се оцени ефектът на комбинирано приложение на различни антибактериални средства (тест съвместни ефекти).

качествени методи. Качествени методи са по-малко точни от полу-количествена. Според резултатите обикновено фиксирана чувствителност (S), междинният резултат (I) или устойчивост (R). Методът на най-често използваните диск дифузия (известен също като тест Kirby - Bauer), подходящ за бързо растящи организми.

Антибиотични импрегнирани дискове се поставят в агар плочи, върху които се тестват на микроорганизма. След инкубиране (обикновено 16-18 часа) се измерва диаметър на зоната на инхибиране около всеки диск. Всяка комбинация антибиотик микроорганизми имат различни диаметри, които имат стойност S, I, или R.

Други методи, които изискват по-малко строги параметри анализ придържане може да се използва за бърза проверка на отделния организъм устойчиви на дадено лекарство или клас лекарства или специфични антибактериални комбинации (например, устойчивост на оксацилин в метицилин-резистентен Staphylococcus Aureus, производство на В-лактамаза).

Полу-количествени методи. Полуколичествена методи за определяне на минималната концентрация на лекарство, което инхибира растежа на специфичен организъм ин витро. минималната инхибиторна концентрация (MIC) се определя като брой, който след това може да се разглежда като един от три групи: S (чувствителни), I (междинен) или (устойчиви) R. MIC Определяне се използва предимно за бактерии, включително анаероби и Mycobacterium понякога се използва за гъби, особено видове Candida, получени от стерилни сайтове. Минимални неутрализира (бактерицидно) концентрация (MBC) също може да бъде определена, но е технически трудно и стандарти за тълкуване все още не са договорени. MBC анализ стойност е, че показва дали лекарството може да е бактериостатично или бактерицидно.

Антибиотикът може да бъде разтворен в агар или бульон, който след това се добавя към микроорганизъм. Осветлението бульон - златен стандарт, но отнема много време, тъй като само една концентрация на лекарството може да бъде тестван в една тръба. По-ефективен метод използва лента от полиестерен филм ленти, импрегнирани с подходяща антибиотична концентрация. Лентата се поставя в агарова плочка, съдържаща вмъкване материал и IPC определя от местоположението на лентата, която започва ingibitsiya- голям брой антибиотици могат да бъдат проверени на същата плоча.

IPC позволява корелация между чувствителността на микроорганизъм към лекарството и концентрацията на лекарството постижимо в тъкани, не-протеин (свободно лекарство). Ако концентрацията на свободно лекарство в тъканите е по-висока от MIC, вероятността за успешно лечение е висока. По същия начин, данни за S, I и R са корелирани с BMD. Те обикновено се основават на постижими концентрации на свободно лекарство в серум или плазма.

Методи за откриване на нуклеинови киселини,. Тези анализи се базират на методите за откриване на нуклеинови киселини, подобни на тези, използвани за идентифициране на микроорганизма, но модифицирани за откриване на известни гени или резистентност мутации. Пример - МЕСА, ген за резистентност към оксацилин в S. aureus- ако генът присъства, организмът се счита устойчиви на всички-лактамни антибиотици. Въпреки че е известно много такива гени, но тяхната идентификация, няма право на определен извод за устойчивост ин виво. Освен това, тъй като те могат да представят нови мутации или други гени, устойчиви, отсъствието им не гарантира, чувствителност към лекарството. Поради тези причини, а защото тестовете са ограничени по брой и са скъпи, те не се прилагат широко. Методи за откриване на нуклеинови киселини не заменят стандартен тест култура и обичайните анализ на чувствителността.

Имунологични тестове за инфекциозно заболяване

Имунологични тестове, използващи антиген за откриване на антитела срещу патоген или антитяло за откриване на патоген антиген в пробата на пациента. Лечението варира, но ако трябва да се забави анализа на пробата, като правило, трябва да бъде поставен в хладилник или фризер, за да се предотврати свръхрастеж на бактерии.

теста за аглутинация. В аглутинация анализи (например, латекс аглутинация, koaggregatsiya) частици (латекс топчета или бактерия) е свързан с антиген или антитяло реагент. Получените сложни частици се смесват с пробата (например, CSF, серум) - ако е желателно антитяло или антиген присъства в пробата, омрежване на частиците настъпва под формата на аглутинация, която може да бъде измерена.

Ако резултатите са положителни, изследвани последователно биологична течност се разрежда и тествани. Аглутинацията с по-разредени разтвори показва по-високи концентрации на желания антиген или антитяло. Titer правилно записва както реципрочно аглутинация, когато е разреден в примера на разтваряне 32 показва, че аглутинация се проведе в разтвор се разрежда до 1/32 от първоначалната концентрация.

Видео: Laferobion

Аглутиниране тестове обикновено по-бързо, но по-малко чувствителни, отколкото много други методи. Те могат също така да се определи серотиповете на някои бактерии.

свързване на комплемента. Този анализ измерва консумацията на комплемента (свързване на комплемента) на антителата в серума или CSF. Тестът се използва за диагностициране на някои вирусни и гъбични инфекции, особено кокцидиоидомикоза. Пробата се инкубира с известни количества от комплемента и антиген. Степента на свързване на комплемента показва относителното количество на антитела в пробата. Анализът може да се измери титри на IgG и IgM антитела, или може да бъде модифициран за откриване на специфични антигени. Анализ на точна, но е ограничено приложение, отнема време и изисква много средства за контрол.

свързан имуносорбентен анализ. Тези изпитвания се използват антитела, свързани към ензими, за откриване на антигени или откриване и количествено определяне антитела. Свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и ензимен имуноанализ, са най-използваните ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Тъй като повечето чувствителни имуноанализи високо, те обикновено се използват за скрининг. Титрите могат да бъдат определени чрез серийно разреждане на пробата, както и в изследването на аглутинация.

Анализ на чувствителността въпреки че обикновено високо и може да варира в зависимост от възрастта на пациента, серотип микроба, като проба или клиничен стадий на болестта.

Анализ на валежите. Тези тестове измерват антиген или антитяло в телесните течности степен на видима отлагане на комплекси антиген-антитяло в гел (агарозата) или в разтвор. Има много видове анализ на утаяване (например, чрез Ouchterlony двойно дифузия, насрещно имуноелектрофореза), но тяхното използване е ограничено. Обикновено, кръвна проба се смесва с тест антиген за откриване на антитела защитен, често с гъбична инфекция или гноен менингит. Като положителен резултат изисква голямо количество на антитяло или антиген, чувствителността е ниска.

Western блот анализ. Този анализ показва, антибактериални антитела в проба от материал, взет от пациент (например, серум, други телесни течности) от тяхната реакция с антигени (например, вирусни компоненти), които са имобилизирани към блот мембрана.

В Western блот анализ, като правило, добра чувствителност, въпреки че често е по-малка от тази на тестове за скрининг, като например ELISA, но като цяло има висока специфичност. Той обикновено се използва за потвърждаване положителните резултати, получени в скрининг анализа.

Технически изменения линейни Western блот имуноанализ (LIA) - анализ на рекомбинантен имуноблот (RIBA), която използва синтетичен или рекомбинация-binant произвежданите antigeny- и имунохроматографски анализ, който може бързо да се тества проби за специфични микробни антигени или антитела на пациента.

Методи за определяне на не-нуклеинови киселини, за откриване на инфекциозни заболявания

Веднага след като е идентифициран култура тестове организъм, той трябва да бъде идентифициран. методи за откриване киселина не-нуклеинови използват фенотипна (функционална или морфологична) Характеристика на микроорганизми, отколкото генетично идентификация.

Характеристики на растеж на патогена в хранителна среда - размер на колониите, цвят и форма, дават информация за идентифициране на вида и с Грам оцветяване и алгоритъм за по-нататъшни анализи. Предлага множество биохимични testy- всяка характеристика за определен вид микроорганизми (например, аеробни или анаеробни бактерии). Някои изчислите способността на тялото да се използват различни субстрати за растеж. Други оценки присъствие или активността на ключови ензими (например, коагулаза, каталаза). Анализите се правят, стъпка по стъпка. тест последователност е много разнообразна и може да варира леко в различни лаборатории.

методи за откриване киселина Non-нуклеинови могат да се основават на Наръчника на автоматизирани системи, или тя може да бъде хроматографски методи. Някои търговски достъпни комплекти включват отделен набор от тестове, които може да се извърши при използване на една и съща проба материал и обикновено е полезно за диагностика на широк спектър от микроорганизми. Такива системи за анализ могат да бъдат много точни, но може да отнеме известно време, до няколко дни.

хроматографски методи. Микробните компоненти или продукти са разделени и идентифицирани с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC) или газова хроматография. Обикновено, откриване е чрез сравняване на мастни киселини на организма към базата данни. Хроматографски методи могат да бъдат използвани за идентифициране на аеробни и анаеробни бактерии, микобактерии и гъбички. Точността зависи от анализ на качеството на пробата за изпитване на културата и качеството на базата данни, която може да бъде неточна или непълна.

Методи за идентифициране на инфекциозно заболяване, на базата на откриване на нуклеинови киселини,

Въз основа на идентифициране на нуклеинови киселини, показват някои методи за ДНК организъм или РНК се екстрахира от микроорганизъм. Последователностите могат да бъдат амплифицирани ин витро. Въз основа на откриване на нуклеинови киселини, техники обикновено са много чувствителни и специфични и може да се използва за всички видове микроби. Резултатите могат да се получат бързо. Тъй като всеки анализ обикновено е специфична за даден организъм лекарят трябва да знае, диагностичните възможности и да поиска подходящо анализ. Например, ако пациентът има симптоми, насочващи към грип, но грипния сезон свърши, притежаващи общо вирусен диагностичен анализ (например, вирусна култура), а не специален анализ на грип е по-добре, защото друг вирус (например, парагрип, аденовирус) може да бъде причини.

Въз основа на определяне на нуклеинови киселини са качествени тестове, но съществуват количествени методи за определяне на ограничена, но увеличаване на броя на инфекции (например HIV, цитомегаловирус, човешки Т-лимфотропен вирус). Тези методи могат да бъдат полезни за диагностициране и проследяване на отговора на лечението.

Методи, които не включват амплификация на нуклеинова киселина се използват в случаите, когато организмът е първият открити в тестовата култура и присъства в пробата при висока концентрация.

усилване. В методите на амплификация на нуклеинова киселина, като малко количество от ДНК или РНК, възпроизвежда тях много пъти, и по този начин може да открие малки следи от микроорганизма в пробата. Тези методи са особено полезни за агенти, които са трудни за култивиране или идентифицирани с помощта на други методи (например, вируси са облигатни вътреклетъчни патогени, гъбички, микобактерии, някои други бактерии), или за тези организми, които присъстват в малки количества.

Тези анализи могат да включват цел усилване (например, PCR, обратна транскриптаза-PCR [RT-PCR] пристрастие верига усилване, усилване на транскрипцията) усилване на сигнала (например, анализ разклонена ДНК хибрид улавяне), усилване на пробата (например, верижна реакция лигаза на , въвежда форма разцепване цикличен тест) или postamplifikatsii анализ (например, секвениране амплифициран продукт, микрочип анализ и крива ликвидус анализ, както се прави в реално време PCR).

Подходящата проби и съхранение преди пристигането в молекулярната диагностика лаборатория е важно. От амплификационните методи толкова чувствителна, лесна за фалшиво положителни резултати от следа замърсяване на пробата или оборудването може да се инсталира. Въпреки високата чувствителност, понякога има фалшиво отрицателни резултати, дори когато пациентът има клинични симптоми (например, вирусна инфекция на Западен Нил). Фалшиви положителни резултати могат да бъдат сведени до минимум

• като се избягва употребата на клечки за петна с дървени пръчки и съвети на вълната
• бързо транспортиране на проби,
• замразяване или чрез поставяне на проби в хладилник, ако транспортните услуги >2 часа.

Замразяване - типичен метод за съхраняване на анализи на амплификация на нуклеинова киселина. Въпреки това, пробите трябва да се съхраняват в хладилник, а не да бъдат обект на замразяване, ако се подозира, нестабилни вируси (например, херпес зостер вирус, грипен вирус, HIV-2), или ако имате намерение да учат вирусни култури (замразени екземпляри не са подходящи за стандартни култури).