Методи за диагностициране на лабораторни хламидиоза в максиларния синузит

Видео: Отоларинголог Ponidelko SN (SM Clinic)

I. Tsitoskopichesky метод за откриване на Chlamydia

Той предложи два метода, които могат да бъдат разделени в инвазивен и не са агресивни. РЕЗЮМЕ първата е, че материалът за изследването е съдържанието на максиларните синуси, в резултат на игла Kulikovskii на отвора, който след центрофугиране се използва за получаване намазки.

Вторият метод е както следва: след назално anemizatsii 0.1% епинефрин разтвор и прилагане анестезия средната област на назалния проход dikaina 3% разтвор - 0.3 мл, с помощта на специални еднократна четки проведени ограда материал по време на ротационни движения между 10-15 медиалната повърхност на средната назална конха и странична стена назален в областта на параназалните синуси анастомози. Така полученият материал се разпределя равномерно върху стъклен слайд, суши на въздуха и се фиксират в ацетон в продължение на 10 минути при 4-6 ° С Готов тампони могат да се съхраняват, докато изследването в продължение на 2 седмици. при температура от 2-6 ° С

Живопис върху Романовски-Гимза. Ex Tempore багрилото се разрежда с дестилирана вода 1:10. Предметните стъкла се поставят в петри върху дървени пръчки наркотици надолу. Пространството между ход и на дъното на чашата е изпълнен с багрило. Боядисване се провежда в продължение на 45 минути. След това стъклото старателно се промива в течаща вода, суши се с филтърна хартия и се диференцират в подкислен алкохол (100 мл 96% етанол се прибавят 10 капки ледена оцетна киселина). След багрилни препарати се разглеждат в светлинен микроскоп при използване на обектива на потапяне (X90). В този случай, в цитоплазмата на клетките оцветени ядра синьо, - в цитоплазмения включвания хламидия на виолетово-синьо се определят като тъмно синьо или розови microcolonies на фона на синьо цитоплазмата. В стъпка елементарни тела на Chlamydia включвания са оцветени розово стъпка от първоначалните клетки в синьо (Ponidelko SN, 2001 г.). За да се увеличи съдържанието на информацията на метод морфологични изследвания, осъществени в преброяване на броя на неутрофили, лимфоцити и макрофаги в намазки получават преди лечение и динамика под влиянието на лекарства се прилагат.

II. Начин на директна имунофлуоресценция

Намазки получени от soskobnyh материали, както и кръвни намазки оцветяват със смес, взето в работните разреждания поливалентен имуноглобулин флуоресцентен хламидиални и албумин от говежди, белязани с родамин за контрастен фон. Използвайте работно разреждане на серуми 1 / 20-1 / 40. Предметните стъкла с изпитвания материал и се поставя багрилото се поставят във влажна камера в термостат на 30 минути, след което стъклото се отстранява и се промива обилно с фосфат-буфериран физиологичен разтвор (рН 7.2) на магнитна бъркалка в продължение на 1 час, смяна на буфера в 30-та минута. На сушат намазки прилага една капка буфериран глицерол (9 мл глицерол и 1 мл фосфатно буфериран физиологичен разтвор), и след това те са покрити с покритие стъкло (Ponidelko SN, 2001). Препарати разглеждат под флуоресцентен микроскоп "LUMAM-Out". Анализ на приходите се извършва визуално. Резултатите се считат за положителни, ако при получаването открива морфологично типични Chlamydia елементи специфичен флуоресцентен изумрудено-зелен или жълто-зелено:

Chlamydia ретикуларни клетки (РТ) и хламидия клъстер в цитоплазмата под формата на microcolonies, които имат формата на компактни, дифузно оцветяват образувания с различни размери - от 0.25 до 1.5 микрона;
Chlamydia елементарни тела (ВУИ) - образуване, които са предимно извън клетките, сферична или яйцевидна форма с различен цвят периферен ръб във формата на затворен пръстен или semiring размер 0,25-0,5 мм;
intercellularly намира включване - големи ярко зелени петна, образувани са близо един до друг ЕТ.

III. серологични методи

обем на кръвта в 2.5-3.0 мл при индивиди на гладно, взети от кубитална вена в центрофужна епруветка сухо. Тръбата с кръвта, за да се по-добре съсирек прибиране телца се инкубират при 37 ° С в продължение на 40-45 минути. След инкубиране на тръбата се центрофугира 20 минути при 3000 об. / Мин съсирек "обкръжават", и епруветката се поставя за един час в хладилник и след това, при използване на пипета на Пастьор, серумът се отделя от утайката. Серумите бяха транспортирани до лабораторията в следващите 1.5-2 часа или се съхранява при 4-6 ° С в продължение на 1-3 дни. Индивидуални серумни проби съдържат допустими във фризера на хладилника при температура от минус 20-40 ° С, докато серийни проучвания за период не по-дълъг от 6 месеца.

Най-специфичните и информационен (90%) се счита за реакция на индиректна имунофлуоресценция (RNIF). Откриване на антитела срещу хламидия само един серумна проба дори когато тяхното изпълнение титър от 1 / 8-1 / 16 може да показва вероятността на тока като хламидиоза и наличието на следи реакция, свързана с всеки хламидийна заболяване етиология мигрирали последния. Увеличаването хламидиални титри на антитела 1 / 64-1 / 256 и дори по-висок в единична серумна проба на настоящите дълги и сложни форми на инфекция отразява натрупване граница микроорганизъм хуморален отговор и съответните резултати от клинични и епидемиологични анализ и анамнестични данни придобиване диагностична стойност.

Непряко техника имунофлуоресценция позволява идентифицирането на Chlamydia да образуват с подходящи тестови обекти и титруване на серуми по отношение на специфични видове агенти, също така дава възможност да се оцени съдържанието на серумите на отделните класове имуноглобулини в присъствието на търговски флуоресцентен Ig М, А, G. отрицателни резултати от серологичните тестове не изключва наличието на остра или хронична (продължителна) хламидиоза (Ponidelko SN, 2001 г.).

Използването RNIF синузит при пациенти определяне титър Chlamydia антитела в серума. Както се използва антигенни препарати, приготвени на намазки на граничи слайдове на микробни суспензии, фиксирани за 30 минути със студен ацетон. Материалът за суспензии намазка са смес на жълтъчната торбичка на пилешки ембриони или органи на бели мишки, инфектирани с В. трахоматис, С пневмония и С PSITTACI.

Тези антигенни препарати, имащо специфичност за нивото на род, осигуряват идентификация на Chlamydia антитела (АТ) епидемиологично значими за всички видове хламидия. серум тест при разреждане от 1: 2 до 1: 256 се прилага тампони, стъкло, поставени във влажна камера и се инкубират при 37 ° С в продължение на 15-20 минути. След излагането на изпитваното вещество се изплаква с течаща вода, след това стъклото се потапя в чашата на батерията с фосфат-буфериран физиологичен разтвор рН 7.2-7.4, и след това се изплакват с дестилирана вода. След изсушаване при стайна температура, за да предизвика намазки, взети на работа разреждане на заешки имуноглобулин луминесцентно анти-човешки и поставяне на стъклото във влажна камера, инкубират се при 37 ° С в продължение на 15-20 минути. След оцветяване смес се отстранява, стъклото се промива във фосфатен буферен физиологичен разтвор рН 7.2-7.4 продължение на 10 минути, промива се с дестилирана вода и се суши на въздух.

Микроскопия на оцветени препарати се извършва с помощта на флуоресцентен микроскоп. Интензитетът на флуоресценцията специфичен във формулировките се оценява чрез конвенционален chetyrehkrestovoy скала (Ponidelko SN, 2001):

"++++" - ярка флуоресцентна изумрудено зелено около ЕВ, ясно видими светещи "джанти";

"+++" - достатъчно ярка флуоресценция жълто-зелен цвят, могат да бъдат открити периферни "метал" в ЕТ;

"++" - слаба флуоресценция, патоген морфологично разкрива съвсем ясно, но периферните "метал" в ЕТ едва доловим;

"+" - слаба флуоресценция, цветни недефинирани морфология микроскопия възразят видимо лошо.

За диагностично значими титър на анти-Chlamydia антитела да максимално разреждане на серума, която осигурява специфично оцветяване на не по-малко от "++". При оценката на серуми серологично активност срещу хламидиални антигени за получаване на диагностично значими титри от 1: 8 и по-висока.

IV. Метод на полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция (PCR) е описан за първи път през 1985 г. и се превърна в стандартния метод на ДНК амплификация в много молекулни лаборатории биология. В основата на техниката да олигонуклеотиди насочени повтарящи се цикли на синтеза на ДНК води до репликация в витро цел нуклеотидни последователности. В резултат на усилване може да се получи 1 милиард копия на целева ДНК, които могат да бъдат открити чрез гел електрофореза или чрез хибридизация със специфична сонда, последвано от откриване на хибриди от анализ ELISA (ELISA). PCR има висока специфичност и чувствителност видове до 10 молекули на ДНК (Ponidelko SN, 2001).

След събиране на материал, съгласно горните процедури с помощта на специален четки за еднократна употреба се поставя в стерилни епруветки, 2 мл (epindorfy), приготвен предварително в (0.9% разтвор на натриев хлорид) на буфер. Материал за 2 часа или транспортирани до лабораторията след замразяване до температура минус 18 ° С се поддържа в продължение на дълго време преди изследването.

Резултатът от анализа се счита за положително, ако:

размер ДНК продукт в клинична проба съответства точно на ДНК продукт на контролна проба;
в проба, съдържаща клинична проба и вътрешния стандарт, се идентифицира чрез специфичен ДНК продукт на вътрешния стандарт;
в проба, съдържаща вода (отрицателна контрола), вместо от клинична проба, ДНК продукт се засича.

Резултатът от анализа се счита за отрицателен, ако:

в проба, съдържаща клинична проба, на специфични ДНК продукти, които не могат да бъдат открити;
PCR води до двете контролни проби специфични ДНК продукти не откриват.

Анализът се повтаря, ако:

в проба, съдържаща ДНК контрол, не могат да бъдат открити ДНК-специфични продукти;
в проба с вътрешен стандарт специфични ДНК продукти, които не могат да бъдат открити, и се открива чрез специфична ДНК продукт на отрицателната контрола.

V. Методът на културата за изолиране на Chlamydia

Изолиране на патогена в клетъчни култури (см), предварително третирани с различни антиметаболити, е един от най-добрите методи за хламидия диагноза, така наречените "златен стандарт".

Материалът се приема като най-директен метод имунофлуоресценция (PIF) стерилни специални четки. Взети материал се поставя в транспортното средство. Тъй като транспортната среда е фосфатен буфер със захароза, към който се добавя преди употреба топлинно инактивиран телешки серум при 4% от общия, стрептомицин 50 ug / мл амфотерицин В 25 мг / мл от среда. Доставка материал в лаборатория се извършва (в термос с лед) не по-късно от 2 часа след вземане на проби. Културите извършват с помощта на клетъчна култура LLC + MR2 + L929 + ВНК-21С изкуствено ниско съпротивление. Вземете материал се ламинира върху монослоеве от клетъчни култури, отглеждани върху покривни стъкла, предварително отцежда растежна среда. След това заразените клетъчната култура се поставя в епруветки и се центрофугира в продължение на 1 ч при 3000 об. / Мин, което увеличава броя на вътреклетъчни включвания. След центрофугиране, материалът се излива във флакони, добавете изолационна среда "игла» (Eaglas MEM) с tsiklogeksamidom при концентрация 2 мг / мл. Епруветките се инкубират в термостат при 37 ° С в продължение на 48-72 часа (съответства на времето на цикъла на хламидия), след което Покривните стъкла се отстраняват от монослой с тръби, поставени върху стъклени слайдове надолу монослой в канадски балсам и определяне включване патоген. Преди това, фиксиране и оцветяване се осъществява намазки flyuorestsiiruyuschimi антитела и резултатите се оценяват след 48-72 часа с PIF (използвайки специфични поликлонални и моноклонални антитела). При получаване на отрицателни резултати произведе нов семена (проход) на материала. Инфекция на монослоя и оценка на резултатите клетки се провежда по стандартни методи.

Метод за диагностика разпределение на хламидия в клетъчна култура трябва да се използва по време на целия период на заболяването, с изключение на периода на антибиотична терапия и в продължение на 2-3 месеца. след него. За контрола на лечение, за да се идентифицират жизнеспособните хламидия, които могат да упражняват пълен неговия жизнен цикъл, този метод се използва след 3 месеца. след края на лечението.

VI. метод електронна микроскопия

За да се образуват устойчиви диагностичен хламидиоза в метода на максиларен синузит, използвайки електронна микроскопия. Изследване на биопсия материал носната лигавица и синусите. За тази цел, мукозни секции веднага след оградата са фиксирани в 2.5% глутаралдехид тата 0.1 моларен какодилат буфер при рН 7.4 в продължение на 2-24 часа. След промиване три пъти в буфер какодилат dofiksiruyutsya 1% разтвор на осмиев тетраоксид за 1.5-2 часа. дехидратирането се провежда в алкохоли с увеличаване на лекарствени концентрации в продължение на 15-20 минути и смола импрегниране като смес с Epona aralditom. В заключение, полимеризацията се извършва в инкубатор в продължение на 3 дни. при 37 и 60 ° С След полимеризация semithin секции са получени до 1 микрона дебелина на ultratome LKB-3 (Швеция). Оцветените срезове се извършва съгласно предложен от В. Г. Humphrey, F. Е. Питман (1974), метиленово синьо, лазур-2 и основния фуксин за визуализация и анализ чрез светлинна микроскопия (Ponidelko SN, 2001) метод. В същото време, за да се правят снимки с помощта на photomicroscope «Opton» (Германия). След това се подготвят свръхтънки секции с дебелина 3700 ангстрьома, се поставя на техния размер на окото мед между 200, след което контрастира с наситен разтвор на 30% етанол и оловен цитрат (Рейнолдс). Секциите бяха разгледани под електронен микроскоп «JEM 100S» (Япония) при ускорение напрежение от 80 кВ, с увеличение х5, х10, X30, x50 хиляди пъти. Фото използва тип филм FT-41 Р (Русия).

За диагностика на хламидиални лезии на параназалните синуси е необходимо да се използва специален диагностичен алгоритъм.

Основният принцип на диагностичната търсенето е неговата три етапа.

В първия етап скрининг изследване серума на пациенти с синузит за откриване на Chlamydia антитела показателни за текуща инфекция от ELISA и RNIF и проверка на Chlamydia вида (С. пневмония, С трахоматис, С. psittaci).

Във втория етап чрез PIF и PCR се извършва директно в диагностиката на хламидиален огнища (носната кухина и синусите) и периферни кръвни левкоцити да се установи генерализирана инфекция.

В третия етап на диагноза използване CM определи антибиотични средства чувствителност.

Този алгоритъм е бил тестван в изследването на 97 пациенти, включително и тези с хронични синузит отчетени 28 души, 39 са били пациенти с рецидивиращ остър синузит и 30 - не страдат от заболявания на горните дихателни пътища и влезе в контролната група. Сравнителни информативност различни лабораторни методи за диагностика на хламидиоза сред групите изследваните данни, представени в таблицата.

Сравнителни информативност различни лабораторни методи за диагностика на хламидиоза в синузит

метод	хламидиоза
метод	S. пневмония	С трахоматис	С PSITTACI	само
ДФ	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8.2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14.4%)	7 (7.2%)	46 (47,3%)

Както се вижда от данните, представени в материала от пациенти, диагностицирани с хламидия поликлонално група специфични анти-Chlamydia антитела при 59 (60.7%) пациенти. Въпреки това, използването на други техники за диагностика позволява пълна тяхната идентификация. Когато това се задава приблизително равна на честотата на откриване на S. пневмония и пациенти С трахоматис в материали от синузит (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40.2%).

Така, резултатите от сравнителното изследване на методи за диагностика на хламидиоза показаха висока честота на установяване на Chlamydia с максиларен синузит, който позволява определянето на "Chlamydia етиология синузит" и идентифициране на редица клинични особености, характерни за тази група от заболявания.

"Болест, нараняване и тумор лицево-челюстната"
изд. AK Iordanishvili

Споделяне в социалните мрежи:

сроден