Терапия ефект гени, отговорни за синтеза на протеини актин и сърдечна дистрофин на развитието на хронична сърдечна недостатъчност в пациенти с дилатативна кардиомиопатия инфаркт miokardai

DЗа да се разбере механизмите на развитие и прогресия на hronicheskoyserdechnoy недостатъчност (ЗСН) Research poslednihlet съсредоточено върху оценката на приноса на генетични фактори vrazvitie циркулаторна недостатъчност. Perspektivnympodhodom Това се дължи на факта, че се открива генетичен риск и proiskhoditprognozirovanie усложнения на заболяването до тяхното klinicheskihproyavleny [1, 2]. По този начин, в момента на молекулно патогенезата на кардиомиопатии urovnerassmatrivaetsya като proiskhoditnarushenie в процеса на генната експресия, по-специално mehanizmovpretranslyatsii, превод и posttranslyatsii, което води до izmeneniyufenotipa [2]. Известен работа за идентифициране на генетичен faktorovrazvitiya CHF при пациенти с дилатативна кардиомиопатия (DCM), по-специално при тези пациенти разкри мутации в различни uchastkahgenov отговорни за синтеза на белтъка дистрофин и актин [3, 4,5, 6].
Все още няма публикувани данни за mutatsiigena дистрофин и актин при пациенти с инфаркт на миокарда, hotyamozhno предполагат, че подобна мутация е възможно съгласно vliyaniemstressa и неврохормонални механизми за активиране.
В тази връзка, целта на работата е била issledovaniegenov преструват и дистрофин при пациенти с идиопатична кардиомиопатия, UY хора с инфаркт на миокарда.

Материали и методи

В issledovanievklyucheno 130 пациенти, включително и 104 мъже и 26 жени, vozrasteot от 21 до 88 години. Пациентите са разделени в три групи: първо група- macrofocal и пациенти с остър трансмурален инфаркт на миокарда, усложнен CHF II - IV FC от NYHA, втора група - с миокарден miokardabez клинични признаци на сърдечна недостатъчност, 3 групово- пациенти с идиопатична кардиомиопатия CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo група от 30 души, включително 21 мъже и 9 жени, vozrasteot 25 до 76 години (средна възраст 55,5 години) без сърдечно-съдови sosudistoypatologii и без тежки хронични заболявания.
Клинични и демографски характеристики bolnyhpredstavlena масата.
Проучването на гените на преструват и дистрофин proizvodilosv Институт по обща генетика, лаборатория и radiatsionnoygenetiki околната среда Институт по биология RAS ген.
tselnayakrov се използва за извличане на ДНК, взети в епруветка с EDTA при крайна концентрация 50mMili цитрат с крайна концентрация от 0.5%. Изолиране на ДНК provodilis използване на "DiatomTMDNA Prep 200" комплект реактив (произведен от "Biokom"). В основата на изолиране на ДНК, като се използва този naboralezhit използване на лизиращ реактив на ДНК guanidintiotsionatomi сорбент "нуклеоз". В присъствието на високи концентрации guanidintiotsionata (4М) ДНК адсорбира върху активната повърхност на частиците "нуклеоз", а останалите кръвни компоненти остават в средата, която след това се udalyayutsyatsentrifugirovaniem. ДНК промива spirtosolevym буфер zatemsmyvaetsya екстрагенен сорбент със смес от йонообменник и за определяне napryamuyuispolzuetsya полимеразна верижна реакция (PCR) Изолиране на ДНК от цяла кръв, проведено в съответствие с набор instruktsieyispolzovannogo "DiatomTMDNA Prep 200" твърдо "Biokom".
За откриване на мутации в методът на генната kardioaktinaispolzovali на PCR-RFLP, PCR продукт, при което rezhetsyasootvetstvuyuschey рестрикционен ензим, признава точка на интерес nukleotidnuyuzamenu. С рестрикционен ензим Bcl рестрикционен сайт (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens мутация G (норма) на А (мутация), разтворен в 5-екзон ген kardioaktina свързан с идиопатична забавена кардиомиопатия. Sintezpraymerov за научни изследвания пети екзон беше kardioaktina провеждане синтезатор РЕ Applied Biosystems (САЩ). Състав праймери: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR амплификация се извършва както следва rezhimeamplifikatsii: 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 до 30 цикъла.
Размерът на амплифицирания фрагмент 222 parynukleotidov. Крайните концентрации на PCR реакционната смес: 67 mMTris Hcl в рН = 8,8, 16 тМ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween 20.1 единици. Taq.polimerazy, 200 тМ дНТФ всеки, 0,5 мМ от всеки праймер 10-20ng ДНК изследва, 1,5 тМ MgCl₂,краен обем от PCR смес 30 мл.
За да се анализира амплифициране Резултати 10 mklPTsR продукт се прилага на електрофореза с агарозен гел с 2%. vgele ДНК разработена с етидиев бромид под ултравиолетова светлина от дължината на вълната на 32nm. След визуалните оценки PCR концентрация продукт opredelyaliobem PCR смес, необходими за определяне на ограничение реакция (5 до 10 л на PCR смес).

Изследване на гена на дистрофин

За obnaruzheniyamutatsii в гена на дистрофин използване на PCR метод с sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), при което ispolzuetsyapara за PCR праймери, единият от които съдържа един или два tochechnyezameny. Един от най-замествания е интересна замяна tochechnuyunukleotidnuyu. Принципът на метода е, че температурата prioptimalnoy темперирани праймери при липса на мутация появява специфична честотна лента на PCR продукта, и в случай mutatsiipri същата температура и отгряване праймери amplifikatsiine протича реакцията. Избрани две двойки sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny за откриване миссенс мутация от А до G в 9 ekzonegena дистрофин на нормалната последователност и sootvetstvennosvyazannaya мутация с Х-свързана идиопатична дилатативна кардиомиопатия.
Синтез на грундове за изследване на 5-ти ekzonakardioaktina е извършено на синтезатора PE Приложни биосистеми (САЩ).
Състав на грунд: Данаил 5-GTA ААТ GTT GAC ага cctgtg 5-GAA Общата митническа тарифа CTC TCG СКГ АТС ACG Dm 5-GTA ААТ GTT GAC ага cctgtg 5-GGA ТСС TCT CTC GCA отиде Комитет за
PCR амплификация се извършва както следва: rezhimeamplifikatsii 950S - 40 S, 560c - 30, 740S - 40 за 35 цикъла.
Размерът на амплифицирания фрагмент 160 parnukleotidov. Крайните концентрации на PCR реакционната смес: 67 mMTris Hcl в рН = 8,8- 16 тМ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween 20.1 единици. Taq полимераза, 200 тМ дНТФ всеки, 0,5 мМ от всеки праймер 10-20ng ДНК изследва, 1,5 тМ MgCl₂,краен обем от PCR смес 30 мл.
Таблица. Клинични и демографски характеристики на пациентите.

За да се анализира rezultatovamplifikatsii 10 ул от PCR продукт се прилага на 2,5% агарозен гел, показва elektroforez.DNK гел с етидиев бромид под ултравиолетова светлина дълго volny320 нм.
За откриване на точкова мутация в issleduemyhprobah записва amplifitsirovannogofragmenta присъствие или отсъствие на съответната двойка праймери:
1. Наличието на PCR фрагмент от 160 двойки nukleotidovpri усилване праймерна двойка за нормална posledovatelnostiukazyvaet на нормата.
2. Липсата на PCR фрагмент с 160 parnukleotidov усилване праймерна двойка за normalnoyposledovatelnosti показва наличието на планирания мутация.
3. Наличието на PCR фрагмент от 160 двойки nukleotidovpri усилване праймерната двойка за mutatsieypodtverzhdaet последователност с мутацията.

Резултати и обсъждане

Както бе споменато, в литературата няма данни за мутация на ген iaktina на дистрофин при пациенти с исхемична болест на сърцето, по-специално sinfarktom инфаркт, въпреки че под влиянието на неврохормони и други biologicheskiaktivnyh вещества, които се активират в отговор на povrezhdenieserdechnoy мускул (в този случай, инфаркт на миокарда), vozmozhnopredpolozhit подобна мутация. Все пак, въпреки условията на pravilnyeteoreticheskie и нашите очаквания, са открити мутации на гените на изследвани пациенти. Освен това не opredelyalasmutatsiya и при пациенти с дилатативна кардиомиопатия, въпреки че през последните години в изследвания rezultateryada получава достатъчно значителни резултати, поради kotoryekasayutsya дистрофин генна мутация и актин с сърцето nedostatochnostyu.V специално, R. Ortiz-Lopez и сътр. [2] изследва genomnuyuDNK 3 несвързани семейства с Х-свързана забавена кардиомиопатия.Контролната група се състои от 50 лица от женски пол и 50 от мъжки пол neyavlyayuschihsya роднини. За амплификация на ДНК се използва PTSR.V резултат на изследването на един от семейства с Х-свързана DKMPbyla идентифициран ген мутация, кодираща дистрофин lokalizuyuschegosyav хромозома 21, по-специално, намерено замяната на аденин guaninv екзон 9 в позиция 1043, което води до синтеза на хидрофобен nepolyarnoyaminokisloty аланин вместо хидрофилен полярен треонин присъства в дистрофин в позиция 279, относно KN-края на протеин дистрофин. Заместване на треонин с аланин izmeneniyupolyarnosti води до N-края на протеина и следователно до промяна vtorichnoyi дистрофин третична структура. По този начин, този mutatsiyayavlyaetsya доведе до загуба на мембранни стабилизиращи разстройства функция etogobelka и функционална активност на кардиомиоцити, chtoi води до Х-свързан дегенеративни заболявания miokarda- Х-свързана забавена кардиомиопатия.
F. Muntoni и сътр. [4], и Milasini J. и сътр. [5] са описани мутации в други сайтове distrofina.Eti генни части са изследвани R. Ortiz-Lopes и сътр. [3] tehzhe 3 семейства с Х-свързана забавена кардиомиопатия, мутации в тези сайтове са vyyavlenone. Следователно, можем да мислим за различни механизми veduschihk развитие distrofinopaties.
По този начин, всяка мутация distrofinaprivodit до дефицит на инфаркт на протеин, който yavlyaetsyaprichinoy отсъствие на миокарда гликопротеини distrofinassotsiirovannyh [7, 8], отговорни за свързване комплекс multiproteinnogo sbelkami извънклетъчната матрица. Резултатът от тази yavlyaetsyadezorganizatsiya кардиомиоцитите, което води до промяна в mehanicheskoymodeli инфаркт, нарушения на нейното изпомпване функция и сърдечна недостатъчност.
Що се отнася до мутация на сърдечния актин, другарю през 1998 г. публикува хартия Т. Olson и сътр. [6] доказано чрез изследвания на два несвързани semeys автозомно доминантно идиопатична кардиомиопатия (един semyanemetskogo произход, а вторият - на шведски-норвежки). За vsehchlenov извършва ехокардиография, biopsiyamiokarda, DCM идентифицира характерни черти (фокална interstitsialnyyfibroz и кардиомиоцитна хипертрофия). За откриване на генни мутации актин PCR се използва. две единичен ген mutatsiietogo идентифицирани: един - в гена на петата екзон kardioaktina (заместване guaninana аденин, което води до кодираща синтеза на хистидин в 312 mpolozhenii вместо аргинин), а другият - от 6 екзона (замяна adeninana гуанин, в резултат се появява синтез 361-позиция глутамин glitsinavmesto). Но би могло тези промени се считат vramkah kardioaktina ген полиморфизъм. За да се изключи такъв predpolozheniyaprotestirovany 435 несвързани хора, описани мутации не ги vyyavlenou. Следователно, тези изпълнения assotsiiruyutsyaimenno актин ген с идиопатична забавена кардиомиопатия.
Фактът, че нашата работа не може да бъде открит mutatsiyagenov преструват и дистрофин не е пряк изявление, че мутацията не го направи. Може би мутация да има vbolee-късните стадии на заболяването? Трябва да се отбележи, че в nashemissledovanii не проведе генетичен анализ в семейства с idiopaticheskoyDKMP и несвързани лица, са взети. Вероятно за glubokihvyvodov също се нуждаят от голяма част от населението по отношение issledovanie.I не може да бъде по-малко значими гени учебни drugihstrukturnyh компоненти на сърдечния мускул, по-специално kollagenai еластин мутация, която може да има стойност в razvitiiHSN.

Литература:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic генетични аспекти на хронична сърдечна недостатъчност ivozmozhnosti корекция на наркотици. / Diss. ... д-р мед. nauk.- М. 1998- 287.
2. Bristow М. R. Защо миокарда се провали? Споделено от основна наука. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li Н., J. Су, Goytia V., Towbin J.A. Доказателство за дистрофин missensemutation като причина за Х-свързана забавена кардиомиопатия. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F., Cau М., Ganau A., Congiu R., Arvedi G., Mateddu A., Marrosu M.G., Cianchetti С, Realdi G., Cao A., Melis М.А. Кратко доклад: заличаване на дистрофин мускули promoterregion свързано с Х-хромозомата кардиомиопатия. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasin J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta М., Kraoinovic М., Mateddu A., Angelini С, CameriniF., Falaschi A., Mestroni L., Giacca М. и HMD Study Group , Apoint мутация в 5` сплайс мястото на гена на дистрофин firstintron отговорен за Х-свързана забавена cardiomyopathy.// Hum.Mol. Жене. 1996- 5: 73-9.
6. Olson Т.М., Michels V.V., Thibodeau S.N., тай Y.S., Keating М.Т. Актин, мутации в кардиомиопатия, наследствен форма на сърдечна недостатъчност. // науката. 1998- 280: 750-2.
7. БИЕС R.D., Maeda M., Roberds S.L., HolderE., Bohlmeyer Т., Young J.B., Campbell K.P. А 5` дистрофин duplicationmutation причинява мембрана дефицит на алфа-дистрогликана в afamily с Х-свързана кардиомиопатия. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W.M., Cremer М., Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold Т., Goebel Н. Н., Кирхайзен R., KublerW., Voit Т. и сътр. Х-свързана забавена кардиомиопатия. Novel mutationof дистрофиновия ген. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.