Поляризацията на флуоресценцията метод антитяло. корелация на имуноглобулин

За да се отговори на въпроса за съществуването на независим въртене субединици на имуноглобулини голяма помощ е методът на поляризация на флуоресценцията. Основният подход, който се използва в тези експерименти за изследване на имуноглобулини гъвкавост състои в сравняване на експериментално определеното време съотношението на имуноглобулинови молекули, открити в експеримента характеризиращи време молекула на равнина поляризирана светлина, с време на корелация изчислява на предположението, че твърдостта на молекулата.

Така че, ако приемем, че молекулата IgG твърда елипсоид въртене оси със съотношение от 1: 2 и молекулно тегло 150 000, време на съответствието на молекулата трябва да бъде равна на 73 наносекунди и експериментално наблюдава, е обикновено много по-ниски: 20-40 наносекунди. Това показва способността на фрагментите на независимия относителното движение и следователно на гъвкави свързващи части на полипептидните вериги. Подобни данни са получени от спин маркери.

Stayer и Грифит (Stryer, Griffith, 1965) за определяне на време връзката на спин-белязан хаптен свързан към антитяло, изследва поведението на материята, съдържащ както група флуорохром, етикет въртене и на различни вискозни разтвори.

Чрез промяна на вискозитета разтвор чрез прибавяне на глицерол, постигна EPR спектър съвпада с спектъра на спин-белязан хаптен свързан към активното място. След това, методът на флуоресцентната поляризация се определя от времето на корелация. Така намерено е намерено време корелация N-О група, свързана спин-белязан хаптен да бъде 12 наносекунди. Авторите правилно отбелязват, че тази стойност може да бъде твърде ниска в сравнение с време корелация Fab-фрагмент, тъй като не може да се изключи възможността на въртене на пръстен относителна imminoksilyyugo динитрофенил група, неподвижно свързан с активния център. Този недостатък е обща за всички опити да се определи времето на съответствието на IgG Fab-фрагмент използване спин-белязан хаптен.

">

Hsia и Piette (Hsia, Piette, 1969) за определяне на съотношението време, свързани с активния център на спин-белязан хаптен, зависимостта калибриране на вискозитета на EPR спектрите на разтвор спинов маркер. Времето на корелация, съответстваща на определен обхват, определен от закона Stokes '- Einstein, като се има предвид, че ефективното Stokes радиус на марката е 5 А. краткия спин-белязан хаптен най-плътно свързан към активното място, имаше време съотношение от 39 наносекунди.

Dweck сътр (Dwek напр. с., 1975a) изчислено време корелация на спин-белязан DNP локализиран в активните центрове IgA (МОРС 315) и Fab- и Fv-fragmsntov. Беше установено, че е 44.4, 23 и 6,5 наносекунди, съответно.

получено заешки антитела от директно срещу завъртане етикет 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-амино (N-dichlorotriazine) обслужва от имунизация с хаптен. В резултат на образуването на специфични комплекси на антитяло, както и фрагменти пептични papannovyh с етикет завъртане има силната си обездвижване. Смесване на подходящи количества разтвори неспецифично заек IgG и етикети подобни условия доведоха само във външния вид на ЕПР спектър на свободна етикет. Етикетите на време корелация изчисляват чрез Shimshiku и McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). е установено, че са 32, 30 и 18 наносекунди съответно за комплекси завъртане етикет с антитяло, Fc-и Fab-фрагменти в изоелектричната точка (рН 6.3).
Получените стойности на времето корелация IgG за Fab-фрагменти и потвърдено в цитирания документ.

Разликите във времето корелация, получена за Fab-fratmenta като изолира и е част от F (аб) 2 и интактно антитяло посочва ограниченията на свободата на въртене Fab-фрагменти, субединици, наложени от взаимодействие F (аб) 2 и IgG. Повишаване на температурата води до намаляване в редуцира до стандартни условия (3 * 105 P / ° С), време на съответствието етикети комплекси с F (аб) 2 и IgG.

Очевидно е, че при нагряване свобода относително ги местите субединиците се увеличава. Възможността за получаване на антитела към радиоактивна част, поднесени от имунизация с хаптън се потвърждава в друго проучване (Хъмфрис, Макконъл, 1976).