Преимплантационната генни диагностика

Нейната комбинация с тест за анеуплоидия може да подобри резултатите от ин витро. ДНК за преимплантационния genodiagnostic получава от полярен тяло, биопсия стъпка на раздробяване или зигота биопсия бластоциста на.

ДНК анализ се извършва на полярен тялото на процедурата на яйцеклетка етап II. Основният недостатък на този метод се състои в това, че, за да се потвърди на генотипа на ембриона, не се изисква пренатална диагностика. В рекомбинация на хромозомите в първото мейотично деление може да доведе до погрешна диагноза. В повечето центрове изпълняват ембриони биопсия, която може да открие заболяването, наследен от или майка. Биопсия материал обикновено се получава в етап смачкване зигота (стъпка осем клетки) избиране клетки 1-2. Поради трудностите, свързани с диагнозата на толкова ограничен материал (вж. По-долу), в идеалния случай по-добре биопсия бластоцист, тъй като тя съдържа до 300 клетки. В допълнение, биопсията може да бъде взето трофобластни клетки, защото те са по-лесно достъпни и да не пречи на нормалното развитие на ембриона. Въпреки това, бластоцист биопсия се извършва не във всички центрове поради сложността на неговото отглеждане на клетки в култура и понижена преживяемост на бластоцисти след криоконсервация. Въпреки това, с помощта на тези методи, е възможно да се постигне бременност, и с течение на времето, с опит, ефективността им вероятно ще се увеличи.

Материалът получен при биопсия, се анализира чрез един от следните два метода: PCR или флуоресцентна хибридизация на място. Лаборатории, извършващи такива тестове трябва да има сертификат в доклада си, показват кой метод е бил използван, както и резултата от декодирането на резултатите. Независимо от това, специалист по плодовитост е изключително важно да се разбере на молекулярни и генетични методи за преимплантационния genodiagnostic, техните приложения и присъщите им недостатъци.

PCR

PCR е най-подходящ за диагностика на моногенни zabolevanij го използват, за да се определи пола на ембриона е също, макар че това ще все флуоресцентното хибридизация на място. Да се ​​идентифицират чрез PCR мутация в определен ген, е необходимо преди IVF да знаете какво да търсите мутации, и предварително избрани реакционни условия. Във всяка реакция трябва да бъдат включени в съответните положителни и отрицателни контроли, в противен случай резултатите не могат да се има доверие. Трябва да се помни, че по време на реакцията може да бъде и с редица предизвикателства, включително:

1. отсъствие на PCR продукт;
2. проба замърсяване;
3. загуба на алели.

В допълнение, в много центрове, ако имате намерение да кандидатствате за преимплантационна диагностика PCR, прибягват до интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоиди, за да се избегнат евентуални грешки при диагностиката, причинени от въвеждането на обвити в прозрачна и допълнителна сперматозоиди.

Тъй като броят на преимплатационната genodiagnostics на матрична ДНК за PCR не е достатъчно - обикновено няколко пикограма, докато нормално в PCR сто нанограма се използват, е необходимо да се увеличи броят на цикъла на удължаване. Ако PCR ДНК взети от една клетка (или няколко клетки) често изисква 35-60 цикъла, докато стандартната PCR (когато размерът на пробата не е ограничаващ фактор) - около 30. Друго решение е да PCR с вложени праймери (или един загнездена праймер): две последователни реакции на амплификация на малки количества прицелна матрица. През последните години, ние използвахме праймери с флуоресцентен маркер за анализ на много малки количества от ДНК, като по този начин повишаване на чувствителността на PCR е около 1000 пъти и по този начин намаляване на броя на амплификационни цикъла.

За да се премахне замърсяване на пробата трябва да бъде много внимателно получава и реакционната смес се държи reaktsiyu- допълнение, в реакцията включват отрицателна контрола (реакционна смес, съдържаща всички съставки с изключение на ДНК). Ако се установи отрицателна контрола PCR продукт, възможността от замърсяване на пробата на чужда ДНК - в този случай, PCR води до останалата част от пробите не може да се вярва. Тъй като използването на праймери с флуоресцентен етикет номер на PCR цикъла по-малко вероятност от замърсяване на пробата долу.

Загуба алел означава, че усилва основно един от алелите, а вторият усилва много слабо или не усилва изобщо. Очевидно е, че това е най-голяма стойност при идентифицирането на заболяване с автозомно-доминантно унаследяване. Ако "загубен" доминантен алел съдържа мутация, грешката в анализа могат да доведат до прехвърлянето на ембриона в маточната кухина, съдържащ мутант ген. Може да се разширят едновременно различни близко разположени ДНК фрагмент, притежаващ висока степен на полиморфизъм (множествена PCR), за да избегне този проблем. Освен това, както вече бе споменато, може да се подобри чувствителността на PCR, използвайки праймери с флуоресцентен маркер.

Асоциация предимплантационни genodiagnostics Европейската Група за Human Reproduction и ембриология (ESHRE) оцени диагностичната точност на PCR и флуоресцентна хибридизация на място. Съгласно години 1999-2001., В 81 преимплантационния genodiagnostic случай, след PCR се провежда при използване пренатална или постнатална diagnostika- където грешката при диагностицирането на болестите се унаследява Менделовата закони открити в 5 случая (6.2%). Повторни диагностика, за да потвърди резултатите се извършват само половината от преимплантационния диагноза. Необходимо е също така да се вземат предвид случаите, когато това е невъзможно да се извърши биопсия или невъзможно да се диагностицира.

Флуоресценцията на място хибридизация

Този метод се състои в това, че сондата (едноверижна ДНК) провеждане флуоресцентен етикет, хибридизира с ДНК от денатуриран метафаза плоча, отделните клетки или тъкани. метод може да се използва в преимплантационния генни диагностика за:

1. ембриони определяне на пола на Х-свързан заболявания, не съществува възможност за извършване на PCR;
2. откриване на хромозомни транслокации;
3. откриване на промени в броя на хромозомите;
4. откриване на други хромозомни аномалии, като например анеуплоидия.

В проучването на анеуплоидия на възможните технически трудности, свързани с определянето на броя на хромозомите. Ако за анализ на отделните междуфазови клетки са взети, е трудно да се определи точно броят на сигнали (с други думи, хромозомите) когато issleduesh един клетки. Ако виждате само един сигнал, това може да означава, монозомия на тази хромозома, но и припокриващи се сигнали или че хибридизацията на сондата с една от хромозомите се провали. По същия начин, наличието на три или повече сигнали може да означава тризомия, но може да се дължи на технически проблеми: двойно виждане сигнал или анормален флуоресценция. За да разшири възможностите за диагностика могат едновременно да се прилагат най-малко три проби: на Х-хромозомата, Y-хромозома и автозоми един от пример 18 хромозома. В този случай, лабораторията винаги трябва да бъде строго наблюдение на качеството на хибридизацията на диагностична точност е толкова висока, колкото е възможно, тъй като е известно, че в проучването на 100 нормални диплоидни клетки 100 чифта сигнали за всяка хромозома не ще бъде в състояние да получи. Диагностични възможности ще се разшири, ако това ще бъде възможно да се анализират по-голям брой клетки.

В този метод за откриване на транслокации често използваните проби фланкиращи транслокацията или захващащи позиция. Тъй като веднага след приготвянето на IVF ооцитни полярни органи съдържат кондензирани метафаза хромозомни сонди могат да бъдат използвани за "картина" хромозомите в комбинация с центромерни проби за порции (алфа сателитни повторения) и някои локуси. За съжаление, клетки от етап разцепване на зиготата или стадий на бластоцист, такива проби не са подходящи, защото хромозомите не могат да бъдат в метафаза и недостатъчно кондензирани. Един метод, при който се използват сонди за subtelomeric региони на хромозома специфична хромозомна транслокация възниква между тях, и центрометрична сонда част, проксимална по отношение на мястото на транслокация. Такива проби могат да открият в интерфазовите клетки декомпенсирано транслокация, но не може да се прави разлика между нормален хромозома от хромозомни транслокации с компенсирано.

Според доклада на Асоциацията за преимплатационната genodiagnostics Европейска група за човешка репродукция и ембриология, флуоресцентна ин ситу хибридизация даде погрешна резултат в 8 случая на 145, когато след диагнозата на преимплантационния извършва пренатална или постнатална (5.5%). Сред Misdiagnosis - два случая на тризомия, една мозайка тризомия, монозомия и един компенсиран и декомпенсиран транслокация. Освен това, изследването на анеуплоидия е неоткрита тризомия на хромозома 21. Както е случаят с PCR потвърждение на флуоресценция на място резултати хибридизация се извършва за по-малко от половината от жените, които са преминали преимплантационния генни диагностика.

Роля на флуоресценция хибридизация на място при определяне на преместването, днес не е ясно, тъй като 50-70% от случаите, в които родителите са носители компенсирани реципрочни транслокации, когато ембрионите са декомпенсирана проучване преместване. Тези публикувани данни за честотата на успешна бременност след проучвания варират значително, но според данните на трите най-големи центрове на честотата на бременност по отношение на приема на едно яйце е 29%. Някои автори съобщават, че преимплантационния генни диагностика намалява риска от спонтанен aborta- но не е ясно дали тя увеличава скоростта на успешно завършване на бременност в сравнение с естественото зачеване, тъй като повече от половината от ембрионите ще има аномалии и по този начин е по-вероятно, във всеки случай, няма да оцелее. Въпреки факта, че преимплантационния генни диагностика, за да тествате за анеуплоидия многократно е използван с IVF, нито една от публикуваните рандомизирани проспективни проучвания не са показали значително увеличение на броя на успешен резултат на бременност. IVF с преимплантационния диагноза - инвазивна и скъпа процедура, така че е важно да се даде точна очертае практическата роля на този метод.

Асоциация за преимплатационната genodiagnostics Европейската Група за човешка репродукция и ембриология

Начертайте правилните изводи от резултатите от преимплантационния genodiagnostic проведено от PCR и флуоресцентна хибридизация на място, на практика, тя все още не винаги е възможно. Според доклада на Асоциацията за преимплатационната genodiagnostics Европейска група за човешка репродукция и ембриология за 1999- 2001 двугодишния период., Проведено през 1197 ECO цикли както се вижда от резултатите от последваща пренатални или постнатална диагностика, преимплатационната генни диагностика с помощта на PCR са дали погрешна резултат в 5%, и с използването на флуоресценция хибридизация на място - 6% от случаите. също така да се отбележи, че последваща диагностика се извършва по-малко от половината от времето, така че броят на погрешни диагнози може да е твърде ниска. Въпреки това, тези данни не означават, че в 94% от случаите е направена правилна диагноза. Според Асоциацията, общият процент на бременност след прибиране на реколтата на яйца е 17%, биопсия е била успешна в 97% от случаите, диагностика и в състояние да държи само 86% от случаите. Като цяло, това означава, че правилната диагноза на преимплантационна диагностика се прави около 85% от случаите. Тези, които са на път да претърпи преимплантационния генни диагностика, трябва да бъдат предупредени, че в 15% от случаите, на точна диагноза не може да се постави.