Основи на молекулярна терапия. генна терапия

Видео: Най-молекулярната основа на индивидуализация на лечението с чести мутации в NSCLC

Съдържание

Видео: Най-молекулярната основа на индивидуализация на лечението с чести мутации в nsclc
генна терапия

Определяне на местоположението и последователност на гена, чиято мутации причини специфични заболявания, както и най-модерните методи на мутация и тестване може да диагностицира болест нео- и дори пренатална развитие на организма. Това дава възможност за намаляване на проява на генетичен дефект от лечение лекарство, диета, кръвопреливане и т.н.

Въпреки това, този подход не води до коригиране на дефекта и, обикновено, наследствено заболяване не може да бъде излекувана. Ситуацията се усложнява от факта, че мутацията на един-единствен ген може да доведе до най-различни ефекти върху тялото. Ако мутацията води до промяна на ензимната активност, за която кодове, може да доведе до натрупване на токсични субстрат или, алтернативно, на дефицит на съединението, необходима за нормалното функциониране на клетките.

Добре известен пример за такова заболяване е фенилкетонурия. Тя се причинява от мутации в гена за чернодробни ензими fenilalanindegidroksilazy катализира превръщането на фенилаланин в тирозин. В резултат се увеличава ендогенно ниво на фенилаланин в кръвта, което води до неправилно образуване на миелиновата обвивка около аксоните на нервните клетки на централната нервна система и в резултат на това тежко умствено изоставане.

Ако мутацията засяга протеин ген структурна, това може да доведе до сериозни смущения на нивото на клетки, тъкани или органи. Пример за такова заболяване е кистозна фиброза.

Заличаването в гена, кодиращ протеин, наречен на кистозна фиброза транспортер води до синтеза на дефектен белтък (липса на фенилаланин 508) и смущения на транспорт на хлоридни йони през клетъчните мембрани. Един от най-вредните последствия от това е, че слузта, която покрива и предпазва белите дробове, става прекалено дебело. Това усложнява достъп до клетките на белия дроб и допринася за натрупване на вредни микроорганизми. Клетките лигавицата на дихателните пътища на белите дробове, се убиват и се заместват от фиброзна съединителна тъкан (оттук и името на заболяването). В резултат на това, пациентът умира от дихателна недостатъчност.

Наследствени заболявания се различават сложни клинични симптоми и лечението им е traditsinnoe главно симптоматично: за лечение на фенилкетонурия bezalaninovuyu предписаната диета, замени дефектните функционалните протеини чрез интравенозно приложение, за да се компенсира загубени функции, осъществявани трансплантация на костен мозък или други органи. Всички тези мерки обикновено са неефективни, скъпи, трайни и няколко пациенти оцеляват до дълбока старост. Следователно, разработването на нови терапии е много спешно.

генна терапия

Генната терапия се нарича генното инженерство на човешки соматични клетки, насочени към коригиране на генетичният дефект, който причинява болестта. Корекция на конкретните заболявания се извършва чрез въвеждане в дефектните клетки на нормални соматични експресирани гени. До 80 години. Когато са създадени разработени методи за получаване на отделни гени и еукариотни експресионни вектори, става рутинни експерименти за генен трансфер в мишки, генетичен перспектива корекция стане реално.

През 1990 г. в САЩ от д-р W. френски Андерсън (W. френски Andrson) първи опит за генна терапия за лечение на тежък комбиниран имунодефицит (SCID) в тригодишен момиче Ашанти де Силва (Ashanthi да Силва) са били направени. Това заболяване се причинява от мутации в гена, кодиращ adenozanadenilazu (ADA). Недостигът на този ензим улеснява натрупването на аденозин и деоксиаденозин кръв, токсично действие на което води до смъртта на лимфоцити и Т в периферната кръв и, като следствие на имунодефицит.

Деца с това заболяване трябва да бъдат защитени от инфекции (съдържащи се в специални стерилни камери), като всяко заболяване може да бъде фатално. 4 години след началото на лечението на детето е наблюдавано изразяването на нормално функционираща АДА SCID и облекчаване на симптомите, което й позволи да напусне стерилна камера и да живее нормален живот.

По този начин, е доказано по принцип възможност за успешно генна терапия на соматични клетки. От 90-те години. тества редица генна терапия на генетични заболявания, сред които най-тежката, като хемофилия, СПИН, различни видове злокачествени неоплазми, кистозна фиброза и други. В момента са лечими чрез трансгенеза около 10 човешки заболявания.

Множество от генетични заболявания предварително определено множество от развитие на генна терапия подходи. Така решен два основни проблема: средство за доставяне на терапевтичен gena- метод за осигуряване на целево доставяне към клетките, предназначени за корекция. Към днешна дата, всички подходи за генна терапия на соматични клетки могат да бъдат разделени в две категории: (. Фигура 3.15), екс виво терапия и ин виво.

Фиг. 3.15. Схема на екс виво генна терапия (а) и ин виво (а)

екс виво генна терапия включва коригиране на генетичен дефект на клетките извън тялото и след това се връщат на нормално функциониране клетка в организма.

ин виво генна терапия включва доставяне на терапевтичен ген директно в клетките на специфична тъкан на пациента. Помислете за тези подходи в по-големи подробности.

екс виво генна терапия включва следните етапи:
1) осигуряване на клетки с дефицит на пациента и ги култивиране;
2) прехвърляне на желания ген в изолирани клетки чрез трансфекция на терапевтичен ген конструкция;
3) избиране и капацитет генетично коригирани клетки;
4) трансплантацията или преливане на тези клетки в пациента.

Използването на собствените клетки на пациента, да гарантира, че след тяхното завръщане, че не се развива имунен отговор. прехвърляне процедура генен конструкт да бъде ефективна, но нормален ген трябва да се поддържа стабилно и непрекъснато експресира.

Средства за генен трансфер, създадени от природата, са вируси. За да се получат ефективни вектори за доставяне на ген за две групата на вируси се използват главно - (. Виж фигура 3.16) аденовируси и ретровируси. генетично се детоксикира варианти на вируси, използвани в генната терапия.

Фиг. 3.16. Вирусите, използвани за създаване на терапевтични вектори

Помислете за устройството и използването на модели, базирани на ретро-вируси. Припомнете си, че ретровирусния геном съдържа две идентични едноверижни РНК молекули, всяка от които се състои от шест секции: две дълъг краен повтор (LTR) в 5` и 3` завършва последователност некодираща * Р + необходимо за опаковане на РНК в вирусни частици, и три региони кодиращи структурен протеин на вътрешната капсида (GAG), обратна транскриптаза (Pol) и белтък на обвивката (ENV) (фиг. 3.17, а).

Фиг. 3.17. Генетичната карта на типичен ретровирус (а) и карта ретровирусен вектор (а)

Спомнете си, че ретровирус жизнен цикъл се състои от следните стъпки:
1. инфекция на клетки мишени.
2. Синтез на ДНК копие на генома с нативен обратна транскриптаза.
3. Транспортна на вирусната ДНК в ядрото.
4. интеграция на вирусната ДНК в хромозомата на клетката гостоприемник.
5. споразумение иРНК от вирусната ДНК под контрола на силен промотор локализиран на 5`-LTR част.
6. излъчване протеини Gag, Pol и Env.
7. Образуването на вирусен капсид и пакет две молекули РНК вериги и обратна транскриптаза.
8. Освобождаването на вириони от клетката.

При получаването на ретровирусен вектор дължина на ДНК ретро вирус вмъкнат в плазмид се отстрани повечето от гена GAG и напълно гени Pol и ENV и вместо добавя "терапевтичен" ген Т и евентуално маркер селективен Rg ген със собствен промотор (фиг. 3.17, б ). Разположение ген T ще бъде контролирано от силен промотор локализиран на 5`-LTR част. Въз основа на тази схема предоставя различни ретровирусни вектори, и максималният размер на ДНК инсърт от около осем хиляди. Вр

Така получената структура може да се използва самостоятелно за трансформация, но неговата ефективност и последващо интегриране в генома на клетката гостоприемник е изключително ниска. Следователно техника опаковки обща РНК ретровирусен вектор в интактни вирусни частици беше разработен, които с висока честота в клетка и да проникне гарантирано интегриран в генома на гостоприемника. За този така наречен "pakuyuschaya" клетъчна линия е създадена. Двете различни части на хромозомите на клетките зашити ретровирусни гени Gag и Pol-ENV, лишен от способността да се опаковат поради липсата на последователност + (84 * +) (Фиг. 3,18).

Фиг. 3.18. Схемата за получаване на опакован вирусния вектор

Това означава, че и двете от тези фрагменти се транскрибира, но в същото време лишена от РНК празни капсиди. Чрез трансфектиране на вирусния вектор РНК в такива клетки се включи в хромозомна ДНК и се транскрибира до получаване на РНК ретровирус пълна дължина, и при тези условия опаковани в капсиди на само РНК вектор (само съдържа последователност +). Получените интактни вирусни частици се използват за ефективно доставяне на ретровирусен вектор в прицелната клетка.

Ретровирусите заразяват само активно делящи се клетки широко. За прехвърляне на техните гени се третира с пречистени частици от опакования ретровирусен вектор или съ-култивирани с клетъчна линия, тяхното получаване, и след това извършване на избор за отделяне на прицелни клетки и клетките на опаковката.

Трансдуцираните клетки са добре проверени за нивото на синтез терапевтичен ген продукт, липса на компетентен ретровирус репликация, без промяна в способността на клетките да растат или функция.

Особено подходящ за генна терапия са клетки от костен мозък. Това се дължи на присъствието на тотипотентни ембрионални стволови клетки, които могат да пролиферират и се диференцират в различни видове -B- клетки и Т-лимфоцити, макрофаги, еритроцити, тромбоцити и остеокласти. Тези клетки се използват за лечение на редица наследствени заболявания, сред които вече споменахме тежка комбинирана имунна недостатъчност, болест на Гоше, сърповидно-клетъчна анемия, таласемия, остеопороза и други.

Освен тотипотентни костен мозък стволови клетки, които са трудно да се изолират и култивират употребявани pupovinnoy стволови клетки от кръв (предпочитаното използване на генна терапия за кърмачета) и чернодробните клетки - хепатоцити - за лечение на хиперхолестеролемия.

В ин виво генна терапия е особено важно да се осигури доставяне на терапевтичен ген на дефектни клетки. Такава насочена доставка може да осигурят модифицирано вектори, които се основават на вируси, които могат да инфектират специфични клетъчни типове. Помислете за подход, разработен за лечение на вече споменатите по-горе муковисцидоза. Тъй като белите дробове са отворена кухина, терапевтични гени за доставяне им е сравнително лесно. Клониран вариант на здрави ген се въвежда в инактивиран аденовирус (фиг. 3.19). Специфичността на този тип вирус е, че инфектира лигавицата на белите дробове, което води до студено.

Фиг. 3.19. Схема за получаване на вектор на базата на аденовирус

Проектиран така, че вирусът е тествана чрез напръскване в носа и белите дробове на опитни животни, а след това към хората пациенти. В някои случаи, има въвеждане и експресия на здрави ген, и възстановяване на нормалния транспорт на хлоридни йони. Вероятно този подход (въвеждане на нормален ген чрез назален аерозол) в близко бъдеще ще се използва широко за лечение на симптомите на кистозна фиброза в белите дробове.

Освен ретро и аденовируси в генната терапия експерименти с използването и на други видове вируси, като например херпес симплекс вирус. Отличителна черта на тази двойна ивица (152 хиляди. Bp) ДНК вирус е способността му да удари специално неврони. Има много генетични болести на централната и периферната нервна система - тумори, метаболитни нарушения, невродегенеративни заболявания (болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон).

Херпес симплекс вирус тип I (HSV) вектор е много подходящ за лечение на такива заболявания. На капсида на вируса предпазители с мембраната на неврон, и ДНК се пренася в ядрото. Той предлага няколко начина за прехвърляне на терапевтичен ген чрез HSV-вектори и успешно изследвани върху експериментални животни.

Вирусните вектори имат няколко недостатъка: висока цена, ограничен капацитет на клонирани и възможни възпалителни реакции. Така че, през 1999 г., в резултат на който се развива необичайно силен имунен отговор към вектора на аденовирус е убит 18-годишният доброволец, който взе участие в тестовете на лекарства. През 2002 г., с две деца във Франция през лечение на имунна недостатъчност (въвеждане на терапевтични гени в стволови клетки, използвайки ретровируси) е разработила състояние, подобно на левкемия.

Поради разработен невирусен система ген доставка. Най-лесният и неефективен начин - е инжектиране на плазмидна ДНК в тъканта. Вторият подход - е микропроектилно бомбардиране тъкани злато (1-3 микрона) конюгиран ДНК. Така терапевтичните гени са изразени в целевите тъкани и техните продукти - терапевтични протеини - влиза в кръвния поток. Основният недостатък на този подход е преждевременно дезактивиране или унищожаване на тези протеини с кръвни компоненти.

Доставка на ДНК може да бъде осъществено чрез опаковане в изкуствен липидна мембрана. Така получените сферични частици, липозоми могат лесно да проникват през клетъчната мембрана. Липозомите създадени с различни свойства, но досега ефективността на такава доставка е ниска, тъй като повечето от ДНК се подлага на лизозомни разграждане. Също синтезира ДНК конюгати за доставяне на генетичен конструкт на различни молекули, способни да се гарантира безопасността, насочено доставяне и проникване в клетката.

През последните години, интензивни опити за създаване на изкуствена хромозома 47, което ще позволи да се включи голямо количество генетичен материал с пълен набор от регулаторни елементи за един или повече терапевтични гени. Това ще направи възможно използването на геномен версия на терапевтичен ген и по този начин се гарантира неговата стабилност и ефективно дългосрочно експресия. Експериментите показаха, че създаването на изкуствени човешките хромозоми, съдържащи терапевтични гени е реалистично, обаче, не е ясно как такава огромна молекула въвежда в ядрото на клетката мишена.

Основните проблеми на генна терапия, в допълнение към риска от тежки имунни реакции са трудно дългосрочно съхранение и използване на терапевтично ДНК в тялото на пациента, много мултигенно заболявания, което ги прави трудни за насочване за генна терапия, и риска от използването на вируси като вектори.

NA Warriors, TG Volova

Споделяне в социалните мрежи:

сроден