Хематологични ефекти на новата активност на мутантен р53 в клетъчния цикъл, апоптоза и чувствителността към цитостатици

Нарушения на функцията на р53 са най-разнообразни в различни тумори molekulyarnymizmeneniem човек. Те могат да voznikatlibo дори в нормални клетки и по този начин увеличава veroyatnostobrazovaniya неопластично клонинг на нея, или да бъде uzhev туморни клетки и да се определи по-нататъшен напредък novoobrazovaniya.Sleduet подчертае, че чрез промяна kletochnogotsikla пунктове за регулиране и апоптоза, р53 дисфункция променя chuvstvitelnostkletok на противоракови лекарства.

Като правило, в туморите показва миссенс мутация на р53, privodyaschiek една аминокиселина е заменена с друга, и с най-голямо chastotoymutatsii намерени в три "горещите точки": Kodonah175, 248 и 273. Вероятно, експресията на мутантен р53 отдава kletkedopolnitelnye селективно предимство над клетки, в които се променя в р53 гена водят до загуба ekspressiipovrezhdennogo алел на. Този факт може да се обясни с krayneymere две причини. Първо, мутантен белтък има доминираща negativnymeffektom срещу див тип протеин, т.е. mutatsiyadazhe точка в един от двата алела е в състояние да потисне напълно ohrannuyufunktsiyu р53. На второ място, през последните години има данни, които показват наличието на мутантни форми на р53 новопридобитите дейности ("придобият-на-функция"). Известно е, например, че за schettakih дейности на мутантен р53 може специфично и с vysokoyaffinnostyu свързват MAR / SAR ДНК елементи, което води remodelirovaniehromatina, транс-активиране на промотори на няколко гени (онкоген тус, епидермален рецептор на растежен фактор и др.) И uvelichivatmetastatichesky потенциал туморни клетки. Въпреки molekulyarnyeosnovy новопридобитите дейности и ролята им на практика не е проучвана в kantserogenezapoka процеси.

Опитахме се да се проучи влиянието на наскоро priobretennyhaktivnostey мутант р53 на регулация на клетъчния цикъл, apoptozai чувствителност към цитостатици. За да направим това, са изследвани effektymutantnyh замествания р53 аминокиселина в кодони 175, 248 ili273 е "горещите точки" razlichnyhopuholyah мутации при хората. нов мутант р53 активност се открива чрез трансдукция в култивирани клетки ин витро без produtsiruyuschieendogenny р53. Използването на клетки липсват p53 ekspressiyaendogennogo, е възможно да се премахне наличието на господстващо-negativnogoeffekta и изследване на ефекта на новопридобитата само aktivnosteytransdutsirovannogo мутант р53.

В момента са получили и производни на човешки клетки анализирани myshii конститутивна или тетрациклин-репресират ekspressieyekzogennogo р53. В последния случай, експресия на мутантни r53podavlyalas добавяне на тетрациклин към културалната среда (1mkg / мл). 24-48 часа след subliniykletok контактната трансфер, получен в среда без индукция тетрациклин наблюдавани ekspressiiekzogennogo мутант р53 не е съпроводено с повишаване ekspressiigenov цел див тип р53 (p21WAF1 и др.).

Влияние на новите дейности на мутант р53 в клетъчния цикъл на скоростта на клетъчната пролиферация

Новопридобитите мутант р53 дейност причинява suschestvennoeuvelichenie процент на клетъчната пролиферация. Така, въвеждането на вектора съставно експресиращ мутантен р53-His175, povyshaetskorost възпроизвеждащи р53-отрицателни миши фибробласти linii10 (3) е приблизително 1,5 :. намалява от 23.5 часа до 16 часа в логаритмична фаза на растеж се наблюдава клетъчна популация vremyaudvoeniya Shodnayakartina в случай на тетрациклин-регулирана ekspressiir53-His175 в човешки белодробен карцином клетъчна линия N1299ili миша фибробластна линия 10 (1), което потвърждава svyazvyyavlennyh различия в степента на пролиферация ekspressieymutantnogo точно с р53, и не с всеки вторични промени voznikayuschimiv резултат на непрекъснато избор с екзогенни mutantnymr53 клетки. Трябва да се подчертае, че предизвикването на изразяване на дивия тип р53 на клетъчните контекст не е довело до намаляване, а да uvelicheniyuvremeni удвояване на популацията от клетки или апоптоза.

Ускорение на клетъчната пролиферация под влиянието на наскоро priobretennyhaktivnostey мутант р53 се дължи, както изглежда, им vozdeystviemna регулация на клетъчния цикъл. Анализът на кинетиката на вид mechenyhmitozov след добавяне на 5-бромодеоксиуридин в продължение на 20 мин., Ние opredelyaliprodolzhitelnost отделните фази на клетъчния цикъл в растеж logarifmicheskoyfaze. Установено е, че включването на експресията на мутантния r53znachitelno намалява времето за клетъчния цикъл продължителност скъсяване schetsuschestvennogo S-фаза. Така mutantnyyr53 няма значителен ефект върху продължителността на drugihfaz на клетъчния цикъл.

Наскоро придобит мутант р53 активност, в допълнение към izmeneniyregulyatsii на клетъчния цикъл при нормални физиологични условия, може да промени G1-пункт функция активируем povrezhdayuschimivozdeystviyami. Ние открихме, че индуцирането на експресия mutantnogor53-His175 клетки 10 (1) и Н1299 води до факта, че S-fazuvhodit 1.5-2 пъти по-клетки с ДНК увреждане, indutsirovannymialkiliruyuschim съединение етил метансулфонат (EMS), след р53 див kakekspressiya тип, напротив, намалява пропорционално povrezhdennyhkletok включени в S-фаза. В същото време, prakticheskine р53-His175 засяга дейността на контролно-пропускателен пункт, работещи в G2.

Механизмите, които са определили последиците от новопридобитите aktivnosteymutantnogo p53 в регулация на клетъчния цикъл, докато neyasny.Naibolee правдоподобно е предположението, че тези izmeneniyasvyazany със способността на p53-His175 увеличи израз genamyc. Нейната продукт, както е показано по-горе, може, от една страна, генът на транс-активиране на орнитин декарбоксилаза, и разговори Така заболяване, скъсяване на S-фаза, и от друга страна активира kompleksytsiklin E / Cdk2 и анулират стоп увредените клетки в perehodeiz G1 до S ,

Влияние на новите дейности на мутант р53 в предизвикване на апоптоза

Мутант р53 може да промени ефекта на цитостатици, само izmenyayane регулиране G1-пункт, но също отслабване на индукцията apoptoza.Pri тази нова активност на мутантен р53 действат като naapoptoz причинява увреждане на ДНК и апоптоза, индуцирана от"смърт домейн" ("рецептори на смъртта") В културална среда posledobavleniya TNF-а или анти-Fas. Sleduetpodcherknut че такива ефекти на мутантен р53 в голям stepenizavisyat на специфични аминокиселинни замествания, като апоптоза и евентуално клетъчния контекст. По този начин, р53-His175, много по-силно от p53-Trp248 или p53-His273, инхибира апоптоза, индуцирана от ДНК povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, етопозид). В същото време, на р53-His273 силен от p53-His175, потиска на Fas-индуцирана апоптоза в рак на простатата chelovecheskihkletkah линия РС-3. Освен това, различните mutantnyer53 диференциално засягат апоптоза, индуцирана Fasi TNF-а.

Механизми на действие на новопридобитите дейности в регулацията на апоптозата mutantnyhr53 проучени до доста лошо. Nedavnoobnaruzheno че един начин на такова регулиране може yavlyatsyatrans BAG1 активиране на гена, кодиращ антиапоптотичния beloksemeystva Bcl-2.

Влияние на новите дейности на мутант р53 в химиотерапевтиците chuvstvitelnostk

В допълнение към неспецифични ефекти на чувствителност към tsitostatikamposredstvom промени в регулацията на клетъчния цикъл и апоптозата, novyeaktivnosti мутант р53 може да има повече spetsificheskoedeystvie чувствителност към някои лекарства sredstvamputem промени в регулацията на цели химиотерапия. Използване на хибридизация metodsubtraktivnoy ние идентифицира непознат raneemisheni трансактивиране на мутантен р53 действие и е установено, че група от гени, специфично активира от мутантен р53 ген включва кодиране деокси-UTP-аза. Функция dUTFazy zaklyuchaetsyav хидролиза на dUTP да зареже и пирофосфат. От друга страна, за да се образува сметище sluzhitsubstratom дТТР де ново. Предполага се, че povyshenieurovnya dUTFazy може да доведе до резистентност към 5-флуороурацил, shirokoprimenyaemomu химиотерапевтични средства, чиито механизъм на действие чрез инхибиране на синтеза svyazans дТТР timidilatsintetazy.My чрез потискане активността установено, че индуциране на р53-His175 или p53-His248, както и въвеждането на конструкт експресиращ UTP -azu, дори във всички изследвани култури (белодробен карцином Н1299, rakyaichnika SKOV-3, фибробластен 10 (1) до 1,5-2 пъти повишени chislokletok могат да образуват колонии след излагане на 5-флуороурацил a.Pri тази резистентност към две различни лекарства - metotreksatui адриамицин - не увеличава в същото време на р53-His273, neobladayuschy способността да активира транс-ген UTP-аза не uvelichivalustoychivost данни на клетъчна култура до 5-флуороурацил ..

Очевидно е, че има и други начини, по които мутант р53 дейност vnovpriobretennye влияние chuvstvitelnostkletok на някои цитостатици. По този начин, ние открихме, че vleykoznyh К562 клетки, за разлика от клетка 10 (1) и др., Експресия на р53-His175 причинява значително намаляване chuvstvitelnostik метотрексат. Експресията на този мутант малко съпротивление uvelichivalatakzhe на левкемични клетки да noprakticheski на винбластин действие не се променя чувствителността на етопозид. В същото време, експресията на р53-His273 не понижава, а напротив, няколко povyshalachuvstvitelnost К562 клетки към метотрексат, и винбластин. Mehanizmyetih ефекти са неясни.

По този начин, ние открихме, че новопридобитите aktivnostimutantnyh р53 аминокиселинни замествания в различни позиции razlichnymobrazom засягат чувствителност към различни химиотерапевтични лекарства. Prietom могат да се различават не само на въздействието на различни мутантни р53 вода и същи клетъчен тип, но също и действието на същите mutantav клетки от различен произход. Всичко това е необходимо uchityvatpri продължаващите опити ispolzovatmutatsii р53 да се предскаже резултатите от противоракова химиотерапия.